运动疲劳小鼠皮层-纹状体突触可塑性受损的机制研究

马 婧，陈慧敏，张凌韬，刘晓莉，乔德才

运动疲劳（exercise-induced fatigue，EF）在竞技运动中普遍存在，它不仅严重影响运动员运动技能的执行，并且影响运动员的注意力和信息处理等认知功能（闫东旭等，2019）。长期运动疲劳导致神经肌肉功能下降，从而增加运动员的损伤风险（郭浩等，2021），并可能对其身心健康造成严重危害。因此，探究运动疲劳的中枢调控机制至关重要，但目前运动疲劳的发生或维持机制尚未被完全揭示。

皮层-纹状体突触可塑性被认为是随意运动、运动技巧性学习以及习惯性行为的细胞机制（Di Filippo et al.，2009），运动技巧性学习能够使人脑的突触可塑性发生变化（刘展，2020；任占兵等，2019）。皮层-纹状体突触可塑性能够调节基底神经节环路的功能，从而调控运动。其主要有两种表现形式，即长时程增强（long-term potentiation，LTP）和长时程抑 制（long-term depression，LTD）。纹状体同时接受皮层和丘脑的Glu能神经投射，以及黑质的DA能神经投射（Kreitzer et al.，2008；Kuhlmann et al.，2021），因此，皮层-纹状体突触可塑性同时受Glu能系统和DA能系统的调控。研究证实，皮层-纹状体通路LTP依赖于通过NMDA受体内流的Ca2＋，以及NMDA受体和多巴胺1型受体（dopamine 1 receptor，D1R）的共同激活（Chepkova et al.，2012，2013）。而皮层-纹状体通路LTD依赖于通过L型Ca2＋通道内流的Ca2＋，以及代谢型谷氨酸1型受体（metabotropic glutamate receptor 1，mGluR1）、多巴胺2型受体（dopamine 2 receptor，D2R）和大麻素1型（cannabinoid 1，CB1）受体的共同激活（Chepkova et al.，2012；Gubellini et al.，2004）。研究发现，运动能够影响多巴胺能信号通路，增强多巴胺能系统的功能（冯俊鹏等，2019），并且多种运动功能障碍都与皮层-纹状体的突触可塑性异常有关，如亨廷顿舞蹈病（Huntington’s disease，HD）、帕金森病（Parkinson’s disease，PD）和肌张力障碍（dystonia）等模式动物都表现出皮层-纹状体通路的LTP和/或LTD受损（时凯旋 等，2021；Ghiglieri et al.，2019；Nouhi et al.，2017；Peterson et al.，2010）。运动疲劳后小鼠也会出现动作不协调、迟缓僵硬等行为表现，但鲜见关于运动疲劳后皮层-纹状体突触可塑性的变化研究。

前期利用场电位和膜片钳技术研究发现，小鼠运动疲劳后皮层-纹状体的LTP和LTD均受损，纹状体中型棘状神经元（medium spiny neurons，MSNs）自发型兴奋性突触后电流（spontaneous excitatory postsynaptic currents，sEPSCs）的幅度不变，但sEPSCs的频率升高，双脉冲反应比值（paired-pulse ratio，PPR）降低，NMDA/AMPA电流比值降低（Ma et al.，2018）。这些结果表明，小鼠运动疲劳后皮层-纹状体通路的双向突触可塑性受损，突触前Glu释放的概率升高，AMPA受体的功能不变，但NMDA受体的功能降低。

由于皮层-纹状体突触可塑性受Glu能系统和DA能系统的双重调控，因此，在前期研究发现运动疲劳小鼠皮层-纹状体突触可塑性受损的基础上，本研究从Glu能系统和DA能系统入手，分别采用高效液相色谱分析（high performance liquid chromatography，HPLC）和免疫印迹（Western Blot）技术，检测纹状体脑区Glu、DA的浓度，以及Glu受体和DA受体的表达含量，以期进一步揭示小鼠运动疲劳后皮层-纹状体突触可塑性受损的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

2月龄雄性C57BL/6小鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司）分笼饲养，自由进食饮水，自然光照，室温（22±2）℃，相对湿度（50±10）%。小鼠适应性饲养3天后，随机分为对照组（Control，n=24）和运动疲劳组（EF，n=26）。

1.2 运动疲劳小鼠模型的建立

运动疲劳小鼠模型的创建方法同前期研究（马婧等，2018）。首先，对小鼠进行连续3天的适应性跑台训练，15 min/天，跑台速度为10 m/min。检测每只小鼠的最大运动速度，检测方法：小鼠以5 m/min的速度热身运动3 min后，将速度提高至10 m/min运动1 min，随后速度提高1 m/min，直到小鼠跟不上跑台速度，持续退落至跑台后方，该速度即为小鼠的最大运动速度。其次，进行连续7天的重复力竭跑台运动：以5 m/min的速度热身运动3 min后，将跑台速度设定为小鼠最大运动速度的85%，以此速度使小鼠持续运动至力竭。力竭的判定标准：小鼠不能维持预定速度，长期滞留于跑道后方不动，使用手连续触碰驱赶仍无效，并伴有呼吸急促、腹卧跑台、垂头不起等行为表现。Control小鼠暴露在相同的环境中，但不进行跑台运动。

1.3 高效液相色谱分析实验

1.3.1 小鼠纹状体匀浆样品制备

小鼠运动疲劳建模完成后即刻，对小鼠腹腔注射水合氯醛（400 mg/kg）麻醉处死。冰浴中快速分离双侧纹状体，以1∶10（组织质量/高氯酸体积）的体积比加入0.1 N的高氯酸，冰浴中匀浆，4℃14 000 r/min离心15 min后取上清液，用0.22 μm的滤膜过滤，再次4℃14 000 r/min离心15 min后取上清液，置于-80℃冰箱中保存待测。

1.3.2 柱前衍生荧光检测法测定Glu浓度

称取Glu标准品，利用0.1 N的高氯酸溶解分别配制浓度为10、1、0.1、0.01、0.001 μmol/L的Glu标准溶液。配制流动相A（0.1 mol/L磷酸二氢钾溶液，pH 6.6）和流动相B（40%纯甲醇）溶液，真空抽滤，超声波震荡脱气。首先进行仪器管道的清洗，设定流动相的速度为1 mL/min，排空管内的气体。调节流速为0.1～0.2 mL/min，连接色谱柱（QU-3C18-15021）和荧光检测器（RF-20A），柱温箱温度设定为25℃，荧光检测器的激发波长设为357 nm，发射波长设为455 nm。吸取20 μl的标准品溶液/样品匀浆液，加入10 μl邻苯二甲醛（OPA）衍生试剂和10 μl Na2CO3缓冲液，充分混匀后静置30 s，微量进样针抽取20 μl进样到HPLC系统中检测。

利用Glu标准品的不同浓度（10、1、0.1、0.01、0.001μmol/L）及色谱中对应的峰面积，设标准品浓度为横坐标x，峰面积为纵坐标y，计算得到Glu的标准曲线方程。将小鼠纹状体匀浆液色谱图中与标准品具有相同保留时间（±0.1 s）的色谱峰的峰面积带入标准曲线，从而计算小鼠纹状体匀浆液中的Glu浓度。

1.3.3 电化学检测法测定DA浓度

称取DA标准品，利用0.1 N的高氯酸溶解，分别配制成10、1、0.1、0.01、0.001 μmol/L 的标准液。流动相 A：将0.09 mol/L二水合磷酸二氢钠溶液、0.001 7 mol/L辛烷基磺酸钠、0.05 mol/L一水合柠檬酸和50 μmol/L的EDTA混合后，利用磷酸将其pH调至3.0。流动相B：纯甲醇（10%恒流洗脱），使用前经0.22 μm有机膜过滤，超声波震荡脱气，设置流动相的速度为0.2 mL/min。采用QU-3C18-15021色谱柱，柱温箱温度设定为30℃，工作电压0.52 V，灵敏度为0.1 nA。微量进样针抽取20 μl的标准品溶液/样品匀浆液进样到HPLC系统中进行检测。

利用DA标准品的不同浓度（10、1、0.1、0.01、0.001μmol/L）及色谱中对应的峰面积，设标准品浓度为横坐标x，峰面积为纵坐标y，计算得到DA的标准曲线方程。将小鼠纹状体匀浆液色谱图中与标准品具有相同保留时间（±0.1 s）的色谱峰的峰面积，带入标准曲线，从而计算小鼠纹状体匀浆液中的DA浓度

1.4 免疫印迹实验

小鼠运动疲劳建模完成后即刻，对小鼠腹腔注射水合氯醛（400 mg/kg）麻醉处死。冰浴中快速分离纹状体，利用膜蛋白提取试剂盒提取纹状体膜蛋白。将蛋白质样品置于95℃下，煮沸5 min，使蛋白变性。浓缩胶恒压80 V电泳约30 min，待样品进入分离胶后，恒压110 V电泳约100 min。4℃恒流0.25 A的条件下，采用湿转法转膜3 h。随后用5%脱脂奶粉-TBST室温下封闭PVDF膜1 h。TBST洗3次，每次10 min。加入2.5%脱脂奶粉-TBST配置的各一抗溶液，4℃孵育过夜。TBST洗3次，每次10 min。5%脱脂奶粉-TBST配置辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（1∶10 000，Sigma，R4880）室温孵育1 h。TBST洗3次，每次10 min（马婧等，2018）。利用化学发光法进行显影定影，Quantity One软件扫描目的蛋白以及内参的灰度值，将Control小鼠中目的蛋白与内参的比值标准化为100%，EF以与Control小鼠的比值表示。

目的蛋白和内参的一抗浓度及型号信息如下：GluR1，1∶1 000，Abcam ab109450；GluR2，1∶1 000，Abcam ab52932；mGluR1，1∶1 000，CST 12551S；D1R，1∶1 000，Abcam ab81296；D2R，1∶1 000，Millipore AB5084P；β-actin，1∶10 000，Sigma A2066）。

1.5 数据处理

所有数据均以Mean±SEM表示。利用Student’s t-test分析组间差异。双侧*P＜0.05定义为有统计学差异，**P＜0.01为差异显著，***P＜0.001为差异极显著。

2 结果

2.1 运动疲劳后小鼠纹状体Glu能系统的变化

2.1.1 纹状体Glu含量的变化

Glu标准品和小鼠纹状体匀浆液的色谱图如图1所示。根据Glu标准品浓度（横坐标x）和对应的色谱图中峰面积（纵坐标y），计算得到Glu的标准曲线方程：y=369 845x＋1 406 929（R2=0.978 3）。统计结果显示，与Control小鼠相比，EF小鼠纹状体Glu的浓度增加［Control：（8.86±1.57）×10-6mol/L，n=7；EF：（14.23±1.33）×10-6mol/L，n=7；Student’s t-test，P＜0.05；图2］，表明小鼠运动疲劳后纹状体脑区Glu的含量增加。这与前期研究利用膜片钳技术发现的运动疲劳后小鼠纹状体突触前Glu的释放概率升高结果一致（Ma et al.，2018）。

图1 Glu标准品和纹状体匀浆液的高效液相色谱图Figure 1.The HPLC Chromatograms of Glu Standards and Striatal Homogenates

图2 运动疲劳组与对照组小鼠纹状体Glu的浓度对比Figure 2.Comparison of Striatal Glu Concentration between EF and Control Mice

2.1.2 纹状体Glu受体表达含量的变化

2.1.2.1 纹状体AMPA受体表达含量的变化

AMPA受体是离子通道型Glu受体的一种，介导哺乳动物大脑中的快速兴奋性突触传递。AMPA受体在纹状体脑区表达丰富，GluR1亚基和GluR2亚基是纹状体AMPA受体的主要组成亚基，在MSNs和中间神经元中广泛存在（Mao et al.，2013）。

利用Western Blot技术，检测纹状体膜蛋白中GluR1亚基和GluR2亚基的表达含量。结果显示，EF小鼠纹状体GluR1的表达含量与Control小鼠相比无差异［Control：（100.00±10.60）%，n=6；EF：（98.85±8.90）%，n=7；Student’s t-test，P＞0.05；图3A、图3B］，GluR2的表达也正常［Control：（100.00±5.07）%，n=7；EF：（98.93±4.57）%，n=7；Student’s t-test，P＞0.05；图3C、图3D］。EF小鼠纹状体GluR1亚基和GluR2亚基的表达正常，提示，运动疲劳不影响纹状体AMPA受体的表达。

图3 运动疲劳组与对照组小鼠纹状体GluR1、GluR2的蛋白表达比较Figure 3.Comparison of Expression of GluR1 and GluR2 in Striatum between EF and Control Mice

2.1.2.2 纹状体mGluR1表达含量的变化

mGluR1为代谢型Glu受体的一种，已有研究证实，皮层-纹状体LTD依赖于mGluR1（Gubellini et al.，2001）。因此，为了检测mGluR1是否参与运动疲劳对小鼠皮层-纹状体LTD的损害，利用Western Blot技术检测了纹状体mGluR1的表达含量。结果显示，EF小鼠纹状体膜蛋白中mGluR1的含 量 显 著降低［Control：（100.00±9.88）% ，n=6；EF：（47.27±8.90）%，n=7；Student’s t-test，P＜0.01；图4］。提示，小鼠运动疲劳后纹状体mGluR1的表达下调，mGluR1的表达下调贡献于运动疲劳对小鼠皮层-纹状体LTD的损害。

图4 运动疲劳组与对照组小鼠纹状体mGluR1的蛋白表达比较Figure 4.Comparison of Expression of mGluR1 in Striatum between EF and Control Mice

2.2 运动疲劳后小鼠纹状体DA能系统的变化

除了Glu能系统，皮层-纹状体突触可塑性也受DA能系统的调控。激活纹状体DA能系统对于自主运动以及诱导皮层-纹状体突触可塑性均为必需（Centonze et al.，2003）。因此，为了探究运动疲劳是否还通过影响DA能系统，进而影响皮层-纹状体突触可塑性，本研究对运动疲劳后小鼠纹状体DA能系统的变化也进行了探究。

2.2.1 纹状体DA含量的变化

DA标准品和小鼠纹状体匀浆液的色谱图如图5所示。根据DA标准品的浓度（横坐标x）和对应的色谱图中峰面积（纵坐标y），计算得到DA的标准曲线方程：y=114 473x＋248 273（R2=0.948 3）。结果显示，与Control小鼠相比，EF小鼠纹状体DA的浓度显著降低［Control：（6.76±0.88）×10-6mol/L，n=5；EF：（2.36±0.90）×10-6mol/L，n=5；Student’s t-test，P＜0.01；图6］，表明小鼠运动疲劳后纹状体DA的含量降低。

图5 DA标准品和纹状体匀浆液的高效液相色谱图Figure 5.The HPLC Chromatograms of DAStandards and Striatal Homogenates

图6 运动疲劳组与对照组小鼠纹状体DA的浓度对比Figure 6.Comparison of Striatal DAConcentration between EF and Control Mice

2.2.2 纹状体DA受体表达含量的变化

纹状体中DA受体主要有两种类型，即D1R和D2R，两者具有不同的作用。其中，D1R位于直接通路的MSNs中，对于诱导皮层-纹状体LTP为必需，而D2R位于间接通路的MSNs中，对于诱导皮层-纹状体LTD为必需（Calabresi et al.，2019）。

采用Western Blot技术，检测两组小鼠纹状体膜蛋白中D1R和D2R的表达含量。统计显示，EF小鼠纹状体D1R的表达含量显著降低［Control：（100.00±2.44）%，n=6；EF：（60.46±5.85）% ，n=7；Student’s t-test，P＜0.001；图7A、图7B］。并且，EF小鼠D2R的表达含量也显著降低［Control：（100.00±5.45）%，n=6；EF：（54.70±7.85）%，n=7；Student’s t-test，P＜0.001；图7C、图7D］。提示，小鼠运动疲劳后纹状体D1R、D2R的表达均下调，D1R的表达下调可能与皮层-纹状体LTP受损有关，而D2R的表达下调可能与皮层-纹状体LTD受损有关。

图7 运动疲劳组与对照组小鼠纹状体D1R、D2R的蛋白表达比较Figure 7.Comparison of Expression of D1R and D2R in Striatum between EF and Control Mice

3 讨论

3.1 Glu能系统在运动疲劳损害皮层-纹状体突触可塑性中的作用

前期研究发现，EF小鼠MSNs的sEPSC频率升高、PPR降低，两者一致表明，小鼠运动疲劳后纹状体突触前Glu的释放概率升高（Ma et al.，2018）。本研究采用HPLC技术进一步检测纹状体Glu的浓度，发现小鼠运动疲劳后纹状体Glu的浓度升高。运动疲劳后，小鼠纹状体Glu的含量以及释放增多，提示，纹状体接受来自皮层椎体神经元的兴奋性Glu能神经投射增强。本研究认为，运动疲劳造成纹状体Glu能神经投射增强，可能形成天花板效应，已经使突触强度达到了饱和，因此给予皮层重复高频刺激时，无法使突触强度再进一步增强，从而抑制了皮层-纹状体LTP的形成，这可能是运动疲劳后小鼠皮层-纹状体LTP受损的分子机制之一。而且，纹状体Glu能神经投射增强，Glu的过度累积也可能是直接导致皮层-纹状体LTD受损的机制之一。

AMPA受体是纹状体脑区介导快速兴奋性突触传递的一种离子通道型Glu受体（陈艳清等，2020）。采用Western Blot检测纹状体AMPA受体GluR1亚基和GluR2亚基的表达含量，发现EF小鼠纹状体GluR1亚基和GluR2亚基的表达含量均正常，运动疲劳不影响纹状体AMPA受体的表达。前期膜片钳实验结果显示，EF小鼠sEPSCs的幅度正常（Ma et al.，2018）。由于记录的sEPSCs为AMPA受体介导的突触后电流，因此sEPSCs的幅度正常表示小鼠运动疲劳后纹状体AMPA受体的功能正常。结合这两项实验结果，运动疲劳后纹状体AMPA受体的表达含量和功能均未见改变，表明小鼠运动疲劳后皮层-纹状体突触可塑性的异常并非是由于AMPA受体异常导致的。

NMDA受体是另一种离子通道型Glu受体，NMDA受体的激活，以及通过NMDA受体内流的Ca2＋对于诱导皮层-纹状体 LTP为必需（Kuhlmann et al.，2021；Shen et al.，2008）。前期实验结果显示，EF小鼠纹状体NMDA/AMPA电流比值降低，提示，小鼠运动疲劳后纹状体NMDA受体的功能下调（Ma et al.，2018）。NMDA受体的功能下调使内流的Ca2＋较少，胞内Ca2＋较低，不足以成功诱导LTP，这可能是运动疲劳损害皮层-纹状体通路LTP的另一个原因。

mGluR1是一种代谢型Glu受体，皮层-纹状体LTD依赖于mGluR1。本研究采用Western Blot检测mGluR1的表达含量，发现EF小鼠纹状体mGluR1的表达含量显著降低。皮层椎体神经元释放的Glu与纹状体MSNs突触后膜上的mGluR1结合，激活G蛋白，与通过L型Ca2＋通道内流的Ca2＋两者共同作用，促使磷脂酰肌醇在磷脂酶C的作用下，经过一系列级联反应，合成内源性大麻素2-AG（张凌韬等，2018）。释放到突触间隙后，2-AG逆行回突触前膜，与突触前膜上的内源性大麻素受体——CB1受体结合，激活CB1受体，继而通过下游一系列分子的作用，最终减少突触前Glu的释放，形成内源性大麻素依赖的LTD（endocannabinoid-dependent LTD，eCB-LTD）（Robbe et al.，2002），这就是皮层-纹状体eCB-LTD的形成过程。内源性大麻素2-AG的合成依赖于mGluR1。因此，本研究认为，运动疲劳后小鼠纹状体mGluR1的表达下调造成内源性大麻素2-AG的合成减少，从而不利于突触前Glu释放的减少，使皮层-纹状体LTD受损。前期研究发现，EF小鼠纹状体CB1受体的表达上调（马婧等2018），这可能是机体对于Glu过度积累、LTD受损做出的一种代偿反应。

3.2 DA能系统在运动疲劳损害皮层-纹状体突触可塑性中的作用

除了接受来自皮层的Glu能神经投射，纹状体还接受来自黑质的DA能神经投射（王炳蔚等，2016）。黑质DA神经元释放DA，与纹状体MSNs突触后膜上的D1R和D2R结合。在背内侧纹状体微量注射D1R和D2R的拮抗剂，能够显著损害运动学习行为，提示，DA能系统在直接和间接通路上的调节作用为必需（Diao et al.，2021）。DA与D1R结合，激活D1R对于诱导皮层-纹状体LTP为必需。使用D1R的拮抗剂或者D1R被敲除的小鼠纹状体均不能成功诱导出 LTP（Kerr et al.，2001；Lovinger et al.，2003）。激活D1R后能够增强环磷酸腺苷和蛋白激酶A的活性，从而促进LTP的产生（Miranda-Barrientos et al.，2014）。DA与D2R结合，激活D2R对于诱导皮层-纹状体LTD为必需（Kreitzer et al.，2007）。DA能系统异常能够损害皮层-纹状体突触可塑性。例如，在PD模式动物中，纹状体DA能神经投射的缺失导致纹状体LTP和LTD的双向受损（Calabresi et al.，2007）。

为了探究运动疲劳后小鼠皮层-纹状体LTP和LTD的受损，是否与DA能系统异常有关，本研究对运动疲劳后小鼠纹状体的DA能系统进行了检测。实验结果显示，EF小鼠纹状体DA的浓度降低，D1R和D2R的表达含量也降低，提示，小鼠运动疲劳后纹状体接受的DA能神经投射减少。这与侯莉娟等（2018）采用免疫组织化学染色观察到的大鼠运动疲劳后D1R和D2R蛋白表达下调的结果一致。小鼠运动疲劳后，纹状体接受的DA能神经投射减少，DA的含量降低，D1R的表达下调，可能是导致皮层-纹状体LTP受损的分子机制之一；而纹状体DA的含量降低，D2R的表达下调，可能是导致皮层-纹状体LTD受损的分子机制之一。

李科等（2019）利用光遗传技术激活DA能系统改善大鼠运动疲劳后纹状体α和β频段震荡的异常，证实DA能系统在调控运动疲劳中发挥重要作用。前期研究发现，小鼠运动疲劳后MSNs的内在膜特性不变、突触前Glu的释放增多、NMDA受体的功能下调（Ma et al.，2018）。本研究进一步发现，小鼠运动疲劳后纹状体DA能神经投射减少。这与已有研究报道的DA能神经投射缺失不影响纹状体MSNs的内在膜特性，但是却增加皮层-纹状体突触终末的Glu浓度和释放（Calabresi et al.，1993；Lindefors et al.，1990），以及下调NMDA受体的功能（Steiner et al.，2010）相一致。提示，在正常的生理状况下，内源的DA能神经投射对Glu能突触传递起着负向的调节作用（余锋 等，2020；Pisani et al.，2005）。因此，本研究认为，运动疲劳导致小鼠纹状体DA能神经投射减少，DA含量降低，D1R和D2R的表达降低，DA能系统功能下调，进而引起纹状体Glu的浓度和释放增多、NMDA受体的功能降低，从而损害了小鼠皮层-纹状体通路的LTP和LTD，造成了小鼠的运动功能障碍。

4 结论

探讨小鼠运动疲劳后皮层-纹状体突触可塑性受损的神经分子机制，发现小鼠运动疲劳后纹状体Glu能系统出现异常，具体表现为Glu的含量增多，mGluR1的表达下调；小鼠运动疲劳后纹状体DA能神经投射减少，DA能系统的功能下调，具体表现为DA的含量降低，D1R和D2R的表达下调。Glu能系统和DA能系统的双重异常可能是导致小鼠运动疲劳后皮层-纹状体突触可塑性受损的原因之一。