大鼠脑缺血再灌注模型改良的探讨*

王棕可 胡跃强

1广西中医学院（广西南宁530001）

2广西中医学院第一临床医学院（广西南宁530023）

Koizumi［1］和 Longa［2］创立的线栓法局灶性脑缺血再灌注模型是目前研究局灶性脑缺血及再灌注损伤的理想模型，是通过阻断大脑中动脉的血流，并可拔出线栓实现再灌注，但因线栓的缺陷，其成功率有待提高。现通过分类对比的方法，将传统与现今模型制作特点总结如下。

1 实验材料

1.1 模型大鼠的选择（1）动物品系。SD和wistar两种大鼠在脑缺血后的梗死体积有所不同。Markgmf等［3］用光化学法脑缺血模型比较了这两种大鼠的梗死情况：SD大鼠可见较恒定的顶颗皮质梗死灶，梗死体积大于wistar大鼠，变异较小，周边可见不完全性坏死区，即半暗带，占总梗死面积的91%。wistar大鼠梗死灶较小，但变异较多，不完全坏死区占总损伤区的30.1%。因此对于脑缺血模型选择SD大鼠优于wistar大鼠。同一种大鼠在体质量恒定的情况下，如果批次、来源不同，大鼠的生理状况会有变异。例如，颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）的直径、颈静脉孔的大小会有不同。相应地在制备线栓的时候就需要调整，入线深度也需要调整。（2）体质量和鼠龄。目前多主张选用体质量280～350g的大鼠。随鼠龄增加，体质量相应增加，动脉直径、颈静脉孔直径也会增加，体质量过大，颅内血管增粗，难以完全阻断；体质量过轻，则难以将线栓插入足够深度。

1.2 线栓制备目前常用制备线栓的材料有尼龙绳和鱼线。传统尼龙绳的栓头用灼烧的方法制作，但灼烧后栓头表面光滑不一，易毛刺、倒钩。 杨雪荣等［4］取直径 0.2～0.25mm 的尼龙线，剪成长60mm的栓线，加热使一端成光滑球面，直径约0.26～0.3mm，在显微镜下观察其光滑程度，不合格削除。但该方法很难掌握灼烧的火候，线头常常太大不易进入血管并且该直径相对于上面提到的大鼠显得太粗。有人提出使用石蜡或硅胶制作栓头。这两种方法较灼烧易控制栓头的大小。蒋祝昌等［5］对石蜡线栓与硅胶线栓进行比较，认为石蜡制作的线栓使模型的成功率明显提高，线栓从ECA进入并结扎翼腭动脉（PPA）的方法出血量少，灌洗效果好，可靠。另一种常用材料是鱼线。鱼线其韧性比较合适插线。鱼线的柔韧性有利于实验中随时改变线栓进入的角度与形状，在保证速度的同时也保证了阻断大脑中动脉的几率。

2 手术的操作

2.1 切口与线栓走向的选择线栓走向的传统方式是将线栓由颈外动脉插入经颈总动脉（CCA）分叉处入颈内动脉（ICA）进而前行阻断大脑中动脉，并结扎翼腭动脉（PPA）。不结扎PPA，线栓易插入PPA内，血液从颈内动脉颅内段大量返流出；若线栓插入颈内动脉颅内段，血液会从PPA中流出，亦会导致大量出血，出血常发生在线栓插入后至结扎固定线栓时间段。操作不熟练时，也极费时。有学者［6］认为PPA的结扎与否并不影响梗死体积和神经缺损体征，即PPA并非是基底节区侧支循环的主要供应血管。大量实验证明，在熟练并不接扎翼腭动脉情况下，只要使栓线有一定程度的弯曲，且保证栓线向屋顶方向弯曲，一般都能将线插如颅内，决不会进入PPA。传统切口的位置选择是在颈外动脉上用眼科剪剪一小口，将线栓由颈外动脉破口处插入，实验证明，在动脉上剪口不易控制大小，边缘锐利，提拉时容易断开。经ECA插线还有2个不足［7］，一是剪断ECA对实验动物的损伤太大，若不剪断，游离ECA，该动脉与ICA之间的角度太小［（28.25±1.37）°］，线栓不易进入 ICA，而且 ECA 比较细，眼科剪很难把握，易把动脉剪断及不能有效控制出血量，再灌注取出栓线时由于心脏压力较大，较容易造成脑内出血导致动物死亡；二是经此处插线，到达大脑中动脉的距离较长，相应的线栓较长，操作时间较长。国内一些学者［8］经改良后采用在ICA、ECA分叉处栓线，即在CCA末端剪一小口，将线插入。研究发现CCA末端附近有颈动脉窦和颈动脉小球。这种方法操作不慎，容易引起实验动物血压升高和呼吸异常。吴松笛等［9］发现从颈总动脉插入的方法，难度比从颈外动脉插入要小，手术更易施行，且不刺激气管，不分离颈内动脉，对血管的机械刺激限制在颈总动脉，对生理结构的损伤小。显微镜直视下可清晰看见蓝色线栓从分叉处进入颈内动脉，常规麻醉后再拔出线栓，可以防止大鼠挣扎导致颈内动脉、Willis环破裂继发蛛网膜下腔出血［10-11］。国内学者［12］结合上述切口位置特点，改良了从颈总动脉插入的线栓法，在实验中以头皮针穿刺动脉的方式导入线栓，操作更简便，成功率更高。

2.2 栓塞的深度与栓塞时间栓线深度过深会导致动物死亡，不足又无法造模成功，因此栓线深度至关重要。一般认为从ECA 或 CCA 分叉处插入，其深度为（18±0.5）mm；曹勇军等［13］在实验中测量发现，经CCA插入的栓线长度为（23±0.5）mm比较适宜，而经ECA插入的栓线长度为（20±0.5）mm比较适宜。因为大鼠的体质量与血管MCA长度呈正相关，并且大鼠的体质量与栓线直径之间有正交互作用，因此栓线的长度、直径要与大鼠的体质量相匹配。在对理想栓线探讨的实验中，关云谦等［14］发现：进入ICA的尼龙线深度超过18～19mm可致使颅内Willis环的血管被尼龙线刺破而形成蛛网膜下腔出血。辛世萌等［15］报道的最佳方案为：大鼠体质量 250～330g、线长17mm或 18mm，栓线直径0.28mm。该方案制作的MCAO模型成功率高、重复性好、生理指标影响小，并且发现栓线插入长度17mm或18mm对造模效果的影响没有统计学上的差异。综合不同的研究结果，对于体质量适宜造模的大鼠，理想的栓线长度为17～18mm；在栓线深度上用有色笔在栓线的20mm处做标记，直到把有颜色的标记送入分叉处，才能保证栓线深度，这时感觉有阻力时即停止插入，并向外稍拉出少许即可。

2.3 术后存活状况和死亡原因据实验观察，脑缺血2h后，大鼠可以存活7～14d，甚至更长时间。术后24h大鼠神经功能受损症状即有好转，存活更长时间的大鼠神经功能缺损症状会有不同程度地恢复。7d时，大鼠活泼性有明显改善，此时即使原来神经功能缺损程度评分很高的大鼠也不能继续观察到原地旋转。一般来讲，手术后大鼠存活期可以满足通常的实验需求，但是，随着栓塞和再灌注损伤时间的延长，死亡率会上升。随着存活时间延长，大鼠的体质量持续下降，缺血4周的大鼠大脑可见明显萎缩［16］。 研究发现，大鼠在术后 24～48h 最容易死亡［17-18］，是严重脑缺血损伤造成的，直接因素是脑水肿。 Abe［19］和 Koizumi［1］的实验可见，梗死3、6h，脑水分由79.8%分别升到81.6%和83.9%；梗死3h再灌注3h则上升到86.4%（干重/湿重法），梗死周围区，即大脑前动脉供血区水分也明显升高。另外，尼龙线刺破颅内血管也能导致动物术后早期死亡，这种情况多见于术中。因线头入颅困难，推进时用力过猛；或者由于尼龙线头端锐利，进入ICA的深度超过18～19mm，致使颅内Willis环的血管被尼龙线刺破而形成蛛网膜下腔出血（SAH）此时，血凝块广泛地凝结在软脑膜毛细血管表面，影响脑微循环；血管壁的损害会影响到血管周围肾上腺素能神经纤维，进而影响血管的正常舒缩功能，这些受影响的血管还容易发生痉挛并加重损伤。SAH大鼠常表现为呼吸道分泌物增多，呼吸困难。术后损伤较重的大鼠，神经功能缺损症状分级高［2，20］，脑水肿也较重［21］。 最终多在 24h 内死亡。

3 结 语

建立反应一致、重复性好的缺血动物模型是研究缺血性脑损伤发生机制及研究干预效果的重要步骤。由以上比较可见，线栓法制备脑缺血模型的成功关键在于控制大鼠的体质量和鼠龄，线栓插入ICA的深度要足够到达大脑中动脉，而且线栓直径要达到一定的要求。控制好易变因素，可避免实验结果的不稳定性。

线栓造模也并非完美无缺，存在着下列不足：线栓造模过程是非直观的手术，血流是否完全阻断不能即刻得知。动物品系、体质量、批次会影响结果。动物饲养条件好的单位所繁育的动物，可以使影响程度降低。实验者的造模技术训练影响结果。严格的训练和足够例数的实践可以复制出稳定的结果，不同的操作者之间的误差较大。操作不小心极易刺破血管或拔线栓时引起出血，轻柔、精细的操作可以减少血管破裂的发生。传统的线栓法不利于新模型制备，如：脑缺血大鼠预处理再灌注模型，此模型需反复短时间大脑中动脉梗死，传统尼龙绳不利于反复缺血操作。

目前缺血预处理已成为新的脑缺血研究热点。成熟的造模方法必定有助于研究的发展。结合传统与现今的造模方法利弊，笔者推测：选择体质量250～300g大鼠，采用头皮针介导，在距离CCA分叉处0.5mm插入鱼线线栓 （栓线直径0.28mm），进入IEA 18mm的方法，是具有易操作、成功率高，可反复进行缺血处理的造模方法，适合现今脑血缺血模型要求的制备方向。

［1］Koizumi J，Yoda M Y，Nakazawa T，et a1.Experimental studies of ischemic brain edema，A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recondition can be introduced in the ischemie area ［J］.Jpn J Sturke，1986，8（12）：1-8.

［2］longa EZ，Wdnstein RP，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery：occlusionwithouteraniotomyinrats［J］.stroke，1989，20（3）：84-91.

［3］Markgmf CG，Kraydieh S，Prado R，et al Comparative histopathlogic coosequence～ofphotothrombotic oct sion ofthe dLstal middle cerebral artety in Sprague-Dawky and wistar rats［J］.Stroke，1993，24（2）：286-293.

［4］杨雪荣，王明远，朱沂.大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的制备和评价［J］.新疆医科大学学报，2008，31（5）：556-558.

［5］蒋祝昌，毕桂南，石胜良，等.石蜡线栓的大鼠局灶性脑缺血再灌注模型［J］.中国临床神经科学，2004，12（3）：303-305.

［6］刘亢丁，苏志强，李毅平，等.实验性局灶性脑缺血再灌注动物模型的改进及评价［J］.中风与神经疾病杂志，1997，14（2）：87-89.

［7］张成英，赵旭东.栓线法制作大鼠局灶性脑缺血模型插线部位的选择［J］.四川解剖学杂志，2004，12（2）：110.

［8］王春霞，刘春风，包仕尧.大鼠局灶脑缺血再灌注模型改良后的实验研究［J］.苏州医学院学报，1999，19（2）：124.

［9］吴松笛，耿晓英，丁桃英，等.改良线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的实验研究［J］.陕西医学杂志，2006，35（10）：1316-1318.

［10］胡凌，高培毅.线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型影响因素的探讨［J］.中国医学影像技术，2004，20（10）：1624.

［11］胡建鹏，王键.线栓法大鼠局灶性脑缺血模型研究中的几个问题［J］.中国比较医学杂志，2004，14（4）：115.

［12］张荣媛，张宏伟，尚爱加.大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型制备及行为学评价标准的改进［J］.军医进修学院学报，2008，19（5）：422-423.

［13］曹勇军，程彦斌.线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的探讨［J］.中国应用生理学杂志，2001，17（2）：198-200.

［14］关云谦，孙明，徐超.大鼠颈内动脉线栓法制备局灶性脑缺血模型及影响因素［J］.国外医学：脑血管疾病分册，2001，9（3）：151-153.

［15］辛世萌，刘远洪，聂志余.栓线长度、直径、及大鼠体质量与栓线法大鼠局灶性脑缺血模型关系的研究［J］.大连医科大学学报，2000，22（2）：105.

［16］Memezawa H，Minamisawa H，Smith M L，et al.Ischemic penumbra in a model of reversible middie cerebral artery occlusion in the rat［J］.Exp Brain Res，1992，89（1）：67-68.

［17］Kuge Y，Mimematsu K.Yamaguchi T，et al.Xylon monofilament for mtralminal middle cerebral artery occlusion in in rats ［J］.Stroke.1995，26（9）：1655-1658.

［18］Nagasawa H，Kogure K.Correlation between cerebral blood flow and histologie changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion［J］.Stroke，1989，20（8）：1037-1043.

［19］Abe K，Yuki S，Kogure K.Strong attenuation of ischemic and post-ischemic brain edema in rats by a novel free radical scavenger［J］.Stroke，1988，19（4）：480-485.

［20］Bederson JB，Pitts LH，Germano SM，et al.Evahuation of 2，3，5-triphenyketrazoliom chloride as a stam for detection and quantization ofexperimentalcerebralinfarctioninrats［J］.Stroke，1986，17（6）：1304-1308.

［21］TakuShigeao，SchrammJ，ShigenoS，etal.Cerebral edema following experimentalsubarachnoidhemorrhage［J］.Stroke，1982，13（6）：368-378.