萝卜与大头菜属间杂种胚的离体培养

甘彩霞，何云启，崔磊，梅雪飞，梅时勇

（湖北省农科院经济作物所，武汉，430072）

萝卜与大头菜属间杂种胚的离体培养

甘彩霞，何云启，崔磊，梅雪飞，梅时勇

（湖北省农科院经济作物所，武汉，430072）

用萝卜雄性不育系DH303A作母本，以大头菜为父本进行属间远缘杂交，杂交后代的初期结荚率为64%～88%，横径第7天停止增加，荚长第8天停止生长，授粉以后第7天开始败育，而且越往后败育得越快。在杂种胚发育后5～8 d进行胚抢救，用生芽培养基（1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.5%活性炭）和生根培养基（1/2 MS+ 0.2 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.5%活性炭）进行离体培养，能成功获得幼苗。

萝卜；大头菜；远缘杂交；胚抢救；离体培养

萝卜（Raphanus sativusL.）是我国栽培的主要蔬菜作物之一，十字花科萝卜属，一、二年生草本植物。原产我国，各地均有栽培，品种极多，常见有白皮萝卜、红皮萝卜、青皮萝卜等。鲜食生食均可，种子含油42%，可用于制肥皂或作润滑油。种子、鲜根、叶均可入药，可下气消积，生萝卜含淀粉酶，能助消化[1]。大头菜（Brassica juncea Coss.var.napiformmisPal et.Bols）是芥菜的一个变种，为根用芥菜，是十字花科芸薹属二年生草本植物。其产品器官为肉质根，质地紧密、水分少、纤维多，肉质根锥形，肉白色，肉质坚实，有强烈的芥辣味，具有宜肺豁痰、开胃理气的作用。芥菜含有丰富的维生素和大量的微量元素、糖类、蛋白质等，供食部分为肥大的肉质根[2]。萝卜和大头菜均为根用蔬菜，但二者的风味不同。到目前为止，还没有关于二者远缘杂交研究方面的报道。为此，本试验将两种材料进行属间杂交，初步研究杂交亲和性的表现，以及对杂种胚抢救培养方法进行探讨。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以萝卜雄性不育系DH303A为母本 （2n=18），大头菜作为父本（2n=18），试验材料种植于湖北省农业科学院蔬菜科技研究中心的试验基地。

1.2 试验方法

试验在湖北省农科院蔬菜科技中心进行。

①播种 大头菜和萝卜种子播种在试验大棚里，常规田间管理。

②套袋、挂牌 萝卜和大头菜抽薹后套袋，如果套袋之前已有开放的花，要将花摘掉。萝卜雄性不育系每个单株单独套袋，挂牌编号标记，共10个单株，所有的数据取10个单株的平均值；大头菜不分单株，混合给萝卜授粉。

③授粉 套袋以后，萝卜与大头菜开花时，进行人工授粉。授粉一般在早上10：00和下午15：00进行。授粉的方法：a.在授粉之前首先用水将手洗干净，然后再用酒精消毒。b.打开纱网袋，摘下已经盛开的大头菜的花朵，摘完以后立即将纱袋封好。c.再打开萝卜植株的纱网袋，将大头菜的花粉授到萝卜的柱头上。为了增加花粉与柱头的亲和性，试验采肖成汉[3]的重复授粉法，即在第1次授粉后的第2天上午再授粉1次），对克服属间杂交不亲和，提高结籽率效果较好。

按以上方法连续授粉7 d，并注意观察花粉与柱头的亲和性。统计授粉花朵数、初期结荚数，计算初期结荚率，初期结荚率 （%）=（初期得到的荚果数/授粉花朵数）×100%。

④胚胎抢救 胚胎抢救的常规方法有3种：子房培养、胚珠培养、胚培养[4]。本试验采用的是第2种方法——胚珠培养。

在试验田取授粉后第3～9天的荚果，用小刀把果柄去掉。将荚果先用无菌水冲洗一遍，然后用70%的酒精消毒30 s，再用0.1%升汞消毒8～10 min，最后用无菌水清洗3遍，每遍清洗3 min。将消毒好的荚果放到已经灭菌的带有滤纸的培养皿中，把荚果上的水分吸干，然后小心地用小刀把胚珠从荚果里剥出来，接种到装有生芽培养基（表1）的培养皿上，操作时要注意无菌、以免污染，一般一个培养皿上接种4～5个胚珠。接种完以后用封口膜把培养皿封好，放到培养箱中培养，培养条件是25℃，光照16 h/d，光照强度2 000 lx，培养30～60 d。观察胚珠在培养基上的生长情况，做好记载。将已经长出的子叶苗转接到生根培养基（表1）上，获得试管苗。

表1 杂种胚珠培养的培养基配方

表2 授粉花朵数和结荚数

胚胎抢救期间，a.测量荚纵径和横径；取荚果之前对每天授粉以后荚果的发育情况进行记载，测量荚长、荚的横径。b.统计结荚率。c.观察并统计杂种胚珠培养的出苗率；通过胚珠培养的结果确定萝卜与大头菜远缘杂交胚抢救的最佳时期。

2 结果与分析

2.1 萝卜与大头菜属间杂交的结荚率

由表2可知，杂交后的初期结荚率为64%～88%，平均初期结荚率为74%。

2.2 萝卜与大头菜远缘杂交形成荚果的生长

从表3可以看出，授粉以后荚果便开始生长，到第8天荚长停止增加，而横径第7天停止生长。而且此时很多荚外观已变黄，胚已经开始败育。因此萝卜与大头菜杂交胚的胚抢救最好是在荚停止生长、胚败育之前即授粉后第7天进行。

2.3 萝卜与大头菜远缘杂交胚抢救的适宜时期

萝卜与大头菜杂交形成杂种胚以后，在一定时间以后就会出现败育现象，即胚黄化萎缩、停止生长，最后脱落。从表3可以看出，授粉以后第7天杂交胚开始败育，而且越往后败育得越快。

由表3可以看出，授粉以后前4天和第8天以后的杂种胚珠培养都没有获得成功苗，授粉后第5～8天培养均获得成功苗。说明萝卜与大头菜属间杂交胚抢救的最佳时期在授粉后第5～8天。

表3 授粉后荚果纵径、横径，结荚情况及胚生长和出苗情况

3 结论与讨论

由于十字花科植物在进行属间、种间杂交时，其后代往往表现胚珠不育[5～11]，具体表现为荚果长到一定程度以后就会黄化，也就是杂种胚胎已经开始败育，本试验中也获得类似的结果。造成胚胎败育的原因可能有多种，但从目前有关的研究成果看，这些原因大致可归纳为7类：胚囊发育异常、胚乳发育异常、幼胚起源、营养供应失调、内源激素、酚类物质、某些酶活及基因调控等方面，归纳起来它们大多有一个共同的特征，即这些胚较之亲本产生了幅度过大的变异，导致胚自身生长不谐调而死亡、或者和亲本不谐调而死亡[4，11～14]。 至于萝卜和大头菜杂种胚败育的原因还有待进一步研究。授粉以后荚果便开始生长，杂交后的初期结荚率在64%～88%，到第8天荚长停止增加，而横径第7天停止生长，授粉以后第7天开始败育，而且越往后败育得越快。在杂交荚发育到5～8 d，采用本试验的生芽和生根培养基能培育出成功的试管苗，而陈树忠等[5]对甘蓝型油菜和羽衣甘蓝杂交子房培养的研究认为，取授粉后第10天的子房培养获得种子成功率较高，时间的差别说明不同物种胚胎抢救的最佳时间不一样。

孟金陵[15]曾对芸薹属及近缘种属植物远缘杂交不亲和性问题作过比较全面的专门综述，并对甘蓝型油菜与近缘种属植物远缘杂交时花粉雌蕊相互作用作了研究。这对于克服油菜与其近缘种属植物远缘杂交不亲和性障碍,提高杂种获得率均具有理论和实际意义。胡大有等[11]认为萝卜与油菜的远缘杂交存在严重的生殖障碍，试验也遇到了杂交不亲和的障碍，但采用重复授粉法可提高其亲和性。目前关于芸薹属植物与萝卜之间远缘杂交不亲和性障碍的研究报道很少，且原因尚不清楚，需要进一步的研究。

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[15]孟金陵.芸薹属植物远缘杂交不亲和性的研究进展[J].中国油料作物学报，1987（4）：71-77.

Intergeneric Hybrid Embryo in Vitro Culture ofRaphanus sativusL.andBrassica junceaCoss.var.napiformmisPal et.Bols

GAN Caixia,HE Yunqi,CUI Lei,MEI Xuefei,MEI Shiyong
(Hubei Provincial Academy of Agricultural Crops,Wuhan 430072)

A male sterile line DH303A ofRaphanus sativusL.as the female parent,crossed with a male line ofBrassica junceaCoss.var.napiformmisPal et.Bols.This was an intergeneric hybrid and their embryo had been developed in medium(1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.5%activated carbon)and the rooting medium(1/2MS+0.2 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.5%activated carbon)after the 5-7 days during budding.Seedlings could be obtained successfully through this procedure.

Raphanus sativusL.;Brassica junceaCoss.var.napiformmisPal et.Bols;Distant hybirdization;Embryo rescue;Hybrid embryos;Culture in vitro

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.08.006

国家科技支撑子课题十字花科及特种蔬菜优异基因源挖掘与种质创新利用研究（2006BAD13B06-4-4）

甘彩霞（1952-），女，硕士，助理研究员，E-mail：gancaixiazhuanye@126.com

梅时勇（1965-），男，通信作者，研究员，E-mail：hbvegbt@163.com

2010-11-26