骨髓间充质干细胞移植对脑缺血模型大鼠记忆功能的影响

刘丽萍 那汉荣(吉林大学药学院，吉林 长春 3002)

骨髓间充质干细胞(MSCs)能自我更新并具有多种分化潜能，近年来的研究发现间质干细胞可以横向分化为外胚层起源的神经细胞〔1〕，进一步研究发现，将MSCs移植到局灶性脑损伤大鼠的脑内能存活、迁移，部分细胞分化为神经元和神经胶质细胞，并能在一定程度上促进脑功能恢复〔2，3〕，使其在神经系统疾病的应用前景更加广泛。且其具有取材方便、体外培养易扩增、生物学特性稳定、免疫原性低及不受伦理道德的限制等优点，成为目前组织工程和再生医学研究的一个新热点。本研究拟通过体外培养扩增大鼠 MSCs，并将经DAPⅠ标记的MSCs注入缺血性脑损伤模型大鼠，观察MSCs移植后在脑损伤大鼠脑组织中的迁徙、定居及对模型鼠学习记忆功能的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂和动物 DMEM培养基(Gibco公司)，胎牛血清(hyclone公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，DAPⅠ(Sigma公司)。5日龄健康Wistar乳鼠(8～10 g)及6周龄大鼠280～350 g由吉林大学实验动物中心提供。

1.2 BMSCs的分离、培养及鉴定 见参考文献〔4〕。

1.3 MSCs的标记 取生长状态良好的3代MSCs，注入前1 d进行标记。弃去MSCs培养瓶中的培养液，用PBS洗涤2次，加入DAPⅠ应用液，10 ml/瓶，置培养箱中1 h后弃去 DAPⅠ应用液，加入含胎牛血清的DMEM培养液，常规培养24 h后，倒置荧光显微镜下观察细胞标记情况。收集细胞备用。

1.4 动物模型制备 采用线栓法制备Wistar大鼠大脑中动脉缺血模型(MCAO)〔5〕。模型大鼠偏瘫清醒后，可见右侧肢体瘫痪，以前肢为重;表现为提尾时大鼠右前肢屈曲、内收，行走时向右侧转圈或倾倒、偏瘫、肢体强直等，提示模型已成功建立。

1.5 DAPⅠ标记的MSCs细胞移植入脑组织 将上述DAPⅠ标记的MSCs浓度调整为1.0×104个/ml，经颈外动脉注入模型大鼠。于注入后24 h、第5天及第10天迅速断头处死大鼠，取损伤的一侧大脑，组织包埋于OCT内，冰冻切片机切成2μm的切片，贴附于玻片上，室温干燥10 min，丙酮固定10 min，激光共聚焦显微镜下观察。

1.6 Morris水迷宫实验 将实验动物随机分为正常组、模型组、PBS注入组及MSCs治疗组。每组6只。手术过程中MSCs治疗组将上述制备的未经DAPⅠ标记的MSCs单细胞悬液浓度调整为1.0×104个/ml，经颈动脉注入模型大鼠，PBS组经相同部位注入PBS。造模后2 w、8 w采用Morris水迷宫进行学习、记忆能力的测定，以大鼠逃避潜伏期代表学习记忆能力，测定方法同文献〔6〕，逃避潜伏期越短，大鼠学习记忆能力越强。

1.7 统计学处理 采用SPSS12.0统计软件包进行统计分析。用±s对数据进行统计描述。

2 结果

2.1 BMSCs的分离、培养及鉴定 通过全骨髓贴壁筛选法分离培养的第3代MSCs，形态呈长梭形;可以向成骨细胞及脂肪细胞分化;经流式细胞仪检测CD44呈阳性，但CD34和CD45造血谱系标记则呈阴性。

2.2 MSCs在脑组织内的迁徒及定位 DAPⅠ标记的MSCs注入MCAO模型大鼠后，激光共聚焦显微镜观察发现，注入后24 h，在损伤脑组织血管内出现荧光标记的MSCs;第5天，损伤组织血管及其周围组织有标记的MSCs弥散;第10天，损伤组织内荧光标记的MSCs广泛弥散。见图1。

2.3 Morris水迷宫实验时间结果 第2、8周时，经方差分析各组间大鼠逃避潜伏期有显著性差异(P＜0.05)。进一步两两比较，模型组与PBS注入组无差异，而MSCs组与正常组、模型组之间相比有显著性差异(P＜0.05)，MSCs组动物空间识别、记忆能力明显强于正常组和模型组，而且MSCs组第8周与第2周结果也有显著性差异(P＜0.05)，表明移植MSCs能有效提高缺血缺氧性脑损伤大鼠学习、记忆功能。见表1。

表1 大鼠Morris水迷宫实验结果(±s，n=6)

表1 大鼠Morris水迷宫实验结果(±s，n=6)

时间 正常组 模型组 PBS注入组 MSCs注入组 F值 P值2 w 22.31±2.96 107.73±9.34 108.62±6.34 53.71±8.78 20.02 ＜0.05 6 w 21.46±2.59 99.94±6.16 100.16±5.74 34.09±5.05 34.31 ＜0.05

3 讨论

脑缺血性损伤后，中枢神经系统坏死的神经组织不能自然恢复。内源性神经干细胞虽然能启动自发修复反应，但数量有限〔7〕。神经细胞损伤后的组织修复与功能重建一直是神经治疗上的难题。瑞典神经病学家Picini等〔8〕从胎儿脑中分离神经组织细胞，植入帕金森病患者的脑内，发现一半以上患者的症状得到改善，而且疗效持续存在。这充分说明神经细胞移植是治疗神经系统疾病的有效手段。但是胚脑组织取材困难，应用受到伦理学和法律的制约，不可能推广到临床。与之相比MSCs具有强大的增殖能力和多向分化潜能，免疫原性弱，易于从骨髓中分离、纯化及体外扩增，越来越受到人们的重视。

MSC应用于脑血管疾病治疗的必要条件是其在脑内的成活并且增殖分化，这是其发挥治疗作用的关键。Li等〔9〕将MSCs直接注入MCAO大鼠纹状体内，28 d后观察到MSCs成活并向缺血区迁移，说明脑缺血或坏死可作为诱导环境，或者脑缺血后可产生一种信息物质(很可能为炎性物质)，刺激MSCs扩增，然后迁移至脑缺血区域，参与修复脑缺血后的神经功能缺损。本实验采用体外培养纯化MSCs方法，纯化扩增MSCs后，经颈动脉注入DAPⅠ荧光标记的MSCs 24 h后MSCs即出现在脑损伤区域血管内，第5天在血管周围组织内开始弥散，第10天在损伤区域可见广泛弥散，说明MSC治疗缺血性脑损伤时能在脑中成活并向缺血部位迁移，参与血管组织修复。

Morris水迷宫是英国心理学家Morris于20世纪80年代初设计并应用于学习记忆脑机制研究〔10〕，该迷宫系统被广泛运用在神经生物学领域的基础和应用研究中，用以检测大鼠的空间学习记忆能力，相对更为客观。本实验采用Morris水迷宫了解MSCs治疗对MCAO大鼠学习记忆能力的影响，结果显示，模型组大鼠学习记忆能力与假手术对照组大鼠相比明显下降，进一步证实了MCAO大鼠模型制作成功。MSCs移植组大鼠逃避潜伏期缩短，空间学习能力明显强于未移植组;说明大鼠的学习记忆障碍改善。Zhao等〔11〕将纯化的人MSCs移植至脑缺血损伤部位，2～8 w后评价大鼠的感觉和运动功能并进行组织学研究，发现接受移植的大鼠在肢体平放实验(limb placement test)中的功能明显改善。Chopp等〔12〕多次将MSCs应用于脑外伤或脑缺血动物模型，发现MSCs大约有1%分化为神经元，5% ～8%分化为神经胶质细胞，并且能明显促进神经功能恢复。Chen等〔13〕认为，MSCs能够通过血脑屏障，到达脑损伤缺血区并分化为神经元和神经胶质细胞，修复缺损的神经组织。这些研究均说明，MSCs可在脑内成活，并可向受损部位迁移，促进神经功能恢复，其机制可能与MSCs合成部分细胞外基质、促进神经元恢复有关，但其调控机制尚不十分清楚，有待进一步深入研究。

1 Black ⅠB，Woodbury D.Adult rat and human bone marrow stromal stem cells differentiate into neurons〔J〕.Blood Cel Mol Dis，2001;27:632-6.

2 Ⅰrons H，Lind JG，Wakade CG，et al.Ⅰntracerebral xeno transplantation of GFPmouse bone marrow stromal cells in intact and stroke rat brain:graft surviva and immunologic response〔J〕.Cell Transplant，2004;13:283-94.

3 Mahmood A，Lu D，Chopp M.Marrow stromal cell transplantation after traumatic brain injury promotes cellular proliferation within the brain〔J〕.Neurosurgery，2004;55:1185-93.

4 朱 勇，陈良万，林若柏，等.SD大鼠骨髓间充质干细胞体外培养、表型鉴定及标记〔J〕.吉林大学学报医学版，2009;35(2):326-41.

5 陈佳俊，石岩殊，韩雪梅，等.线栓法大鼠局灶性脑缺血模型(PMCAO)的实验研究〔J〕.吉林医学，2004;25:16-7.

6 陈罗西，郭玲玲，李 亮.Morris圆形水迷宫的应用及其相关检测指标分析〔J〕.辽宁中医药大学学报，2008;10(8):55-6.

7 Phinney DG，Kopen G，Ⅰsaacson RL，et al.Plastic adherent stromal cells from the bone marrow of commonly used strains of inbred mice:Variations in yield，growth，and differentiation〔J〕.J Cell Biochem，1999;72(8):570-85.

8 Picini P，Brooks DJ，Bjorklund A，et al.Dopamine release from nigral transplants visualized in vivo in a Parkinson patient〔J〕.Nat Neurosci，1999;2:1137-45.

9 LⅠY，Chopp M.Chen J，et al.Ⅰntrastriatal transplantation of bone marrow nonhematopoietic cells improves functional recovery after stroke in adult mice〔J〕.Cereb Blood Flow Metab，2000;20:1311-9

10 Morris RG，Garrud P，Rawlins JN，et al.Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions〔J〕.Nature，1982;297(5868):681-3.

11 Zhao LR，Duan WN，Reyes M，et al.Human bone marrow stem cells exhibit neural phenotype sanda meliorate neurological deficits after grafting into the isehemic brain of rats〔J〕.Exp Neurol，2002;174:11-9.

12 Chopp M，Zhang XH，Li Y，et al.Spinal cord injury in rat:treatment with bone marrow stromal cell transplantation〔J〕.Neuroreport，2000;11(13):3001-5.

13 Chen J，Li Y，Wang L，et al.Therapeutic benefit of intracerebral transplantation of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats〔J〕.J Neurol Sci，2001;189(1-2):49-57.