草坪草抗锈病遗传育种研究进展

张露明，张学勇，王兆明，邵新庆，王赟文

(1.中国农业大学动物科学技术学院草业科学系，北京 100193； 2.辽宁大学生态环境研究所，辽宁 沈阳 110036；3.辽宁省岫岩满族自治县草原监理站，辽宁 岫岩 114300)

锈病(病原菌主要为Pucciniaspp.和Uromycesspp.)是草坪草上常见的一类气传真菌病害，主要危害禾草的叶片和叶鞘。草坪草绝大多数为多年生植物，种类的相对单一性和大面积种植为锈病流行提供了有利的条件。草坪锈病发病初期，病部出现小型褪绿斑点，继而形成黄锈色疱状孢子堆，并散出大量黄色、橙黄色夏孢子。条件适合时，锈病蔓延迅速，发病中心扩大，引起草坪草大片枯黄，绿期缩短，使草坪失去生机，严重时导致草坪草抗逆性降低，甚至植株死亡，显著降低了草坪草的观赏和使用价值[1]。近十几年来，国内外对草坪病害的研究不断深入，在草坪草锈病的病原菌鉴定、流行规律及抗锈性遗传机制方面取得了一系列成果。在草坪草锈病防治方面，通过培育和利用抗锈草坪草品种、聚集抗性基因等遗传改良手段来提高草坪草的抗锈性能受到越来越多的重视。

1 草坪草锈病的病原菌及流行规律

1.1锈病危害及病原菌 草坪草受锈病侵害的时期较长，可以从5月一直延续到11月，主要危害草坪草的叶片和叶鞘。禾草感染锈病后叶绿素被破坏、光合作用降低，蒸腾作用增强,大量失水至叶片变黄枯死。发病初期，叶片和茎上出现浅黄色褪绿斑点，随着病害的发展，病斑数目增多，形成大量的夏孢子堆，严重时孢子堆汇合成条状、线状。孢子堆破裂后从内散发出黄色、棕黄色的夏孢子。病害发展到后期，病部出现铁锈色或黑色的冬孢子堆，远观草坪呈枯黄色。锈病虽然不会引起草坪植物急性死亡，但却导致草坪植物生长不良，抗逆性降低，散出的大量孢子易污染游人的衣物，甚至导致游人过敏，极大地影响草坪的利用价值[2]。据报道[3]我国有19个省市有冷季性草坪草锈病发生,主要为山东、陕西、甘肃、宁夏、河北、青海等地，成都、合肥等地偶有报道，其他省份未见报道。暖季型草坪草锈病报道发生主要集中在福建、台湾、广东等地，上海及南京也有报道[1]。

主要的冷季型草坪草，包括草地早熟禾(Poapratensis)、高羊茅(Festucaarundinacea)、多年生黑麦草(Loliumperenne)等；暖季型草坪草，如结缕草(Zoysiaspp.)、狗牙根(Cynodondactylon)等，均易发生锈病危害。引起草坪草锈病的真菌主要包括柄锈菌属(Puccina)、单胞锈菌属(Uromyces)中的几个种，以及引起地毯草(Axonopuscompressus)锈病的Physopellacompressa和引起狗牙根锈病的狗牙根夏孢锈菌(Uredo.cynodontis-dactylis)。锈菌分类主要是根据冬孢子的形态、排列和萌发的形式。如柄锈菌属可引发草坪草的条锈病和叶锈病，它的孢子形态主要为:冬孢子有柄,双细胞，深褐色，单主或转主寄生。性孢子器球形，锈孢子器杯状或筒状，锈孢子单细胞，球形或椭圆形；夏孢子黄褐色，单细胞，近球形，壁上有微刺[4]。锈菌是专性寄生菌，不同地区及不同寄主的锈病病原物的种类不同。锈菌群体内根据对不同品种的致病力，存在着生理小种的分化。从锈病发生部位区分，草坪草锈病主要有叶锈、秆锈、冠锈等3种。例如，早熟禾、黑麦草、羊茅叶锈病的病原菌为短柄草柄锈菌(P.brachypod)，早熟禾、黑麦草秆锈病由禾柄锈菌(P.graminis)引起，而早熟禾、黑麦草和高羊茅冠锈病的病原菌则为冠柄锈菌(P.coronata)；狗牙根锈病由狗牙根柄锈菌(P.cynodontis)或狗牙根夏孢锈菌引起，结缕草锈病则由结缕草柄锈菌(P.zoysiae)引起[5]。

1.2侵染循环及流行规律 锈菌生活史中可产生多种类型的孢子,最多有5种，即性孢子、锈孢子、夏孢子、冬孢子和担孢子。锈菌一般以夏孢子形式进行传播和侵染，并在草坪草寄主上存活，完成周年循环。在一个生长季，锈菌夏孢子可以连续产生多次，不断传播危害。在禾草茎叶周年存活的地区，锈菌以夏孢子或菌丝体在病部越冬。在禾草地上部分死亡的地区，锈菌则不能越冬，产生的冬孢子不易萌发，在侵染循环中作用不大，第2年春季由越冬地区随气流传来的夏孢子引起新的侵染[6]。锈菌夏孢子的萌发和侵入适温为15～22℃，条件适宜时潜育期一般为8～12 d,需要相对湿度为100%。或在表面有水膜的条件下萌发。因此，空气湿度较大，降雨多或灌溉不当、排水不良的地区锈病易流行。草坪草锈病的发病起始期及发病规律根据各地不同经纬度及温湿度变化有所差异。我国北方地区草坪锈病一般在7-8月为发病最严重的时期，并持续危害到10月；南方地区一般3-4月开始发病，4-6月和秋末冬初有2次发病高峰期[1,7-8]。在美国中部的堪萨斯州，草坪草锈病于8月或9月初发病，病情持续整个秋季[9]；而在北方的阿拉巴马州，锈病病情分别于5月和7月达到高峰期[10]。当昼夜温差较大，植株碳水化合物大量积累时，或者由于过量施用氮肥使草坪草细胞组织更加肉质多汁且细胞壁更薄的情况下，草坪草极易被病原真菌侵染，从而加重病害。此外，机械剪草和喷灌也是造成草坪锈病严重发生的重要因素。在机械剪草过程中，剪草机表面粘着大量病菌孢子，使病菌迅速传播蔓延。喷灌对病菌进一步向新叶传播和促进孢子萌发、侵染提供了有利条件。另外，草坪密度过大，长势过旺，草丛的湿度增大时，也会促进锈病流行，而气温下降，病害症状会随之减轻，草坪草可逐渐恢复正常生长[11]。

1.3草坪锈病防治 草坪草锈病的防治通常采用精细管理、积极预防为基础，并辅以药剂防治的方法。在药剂防治方面，主要使用高效内吸性杀菌剂防治锈病，这类药剂能有效控制锈病的流行。使用较多的是三唑酮类杀菌剂，如三唑酮粉锈宁，对防治锈病有较好的庇护、治疗和铲除作用，尤其是在病菌潜伏期喷施，寄主通常不发病或只出现褪绿病斑[12]。另外，200倍波尔多液或放线菌酮，敌锈钠、石硫合剂、代森锌、70%托布津可湿性粉剂800～1 000倍液也能有效防治草坪锈病[13-14]。喷药的适宜时期为发病前夕或初期，为防病菌抗药性的产生，药剂宜交替使用或混合喷洒。此外，科学施肥、合理排灌等措施也能有效地减少病害发生的几率。在高尔夫球场草坪中，用竹竿或软管除去露水是一种常见的预防措施。然而采用药剂防治既不利于人们的健康，又对环境带来负面影响。国内外研究和生产实践证明，种植抗锈良种是综合控制病害最经济、有效、易行和利于环境安全的核心措施。因此，发掘、筛选和鉴定抗锈病草坪草种质资源，并对其遗传特点进行深入研究，开展对抗锈基因的遗传分析和分子标记定位研究，对寻找抗锈病基因和合理使用抗病基因培育抗病性品种具有重要意义[15-16]。

2 抗锈病性状鉴定与种质评价

抗病性鉴定包括评价寄主品种、品系或种质对病害抵抗或感染程度，衡量草坪草品种对锈病的抗病和发病程度，常用到反应型(感染型)、严重度和普遍率等指标。鉴定方法有自然鉴定、接种鉴定、田间成株鉴定、室内苗期鉴定、离体鉴定等，自然鉴定所需时间较长，调查年限最好在3年以上，以减少环境因素的影响。室内接种鉴定所需时间短，并且发病条件适宜病菌生长；针对不同植物根据需要选择适当的鉴定方法，同时结合几种方法鉴定的结果，以期获得植物全面真实的抗病评价[17]。锈病的发生受到种质材料的抗病能力、病原物的致病力和发病环境的影响。因此，锈病在自然条件下并非每年每地均会严重发生。在进行抗病育种中，除在发病的草坪进行直接鉴定外，有时还必须在人工接种环境下，进行诱发鉴定。通过综合评价抗性鉴定结果，可筛选出具有优良抗病性的种质资源并进一步应用与下一阶段的品种选育。

早在20世纪50年代，欧美一些国家的草坪草育种者就开始收集和筛选优质的抗锈病种质资源，并培育释放了一系列具有抗锈性的草坪草品种。例如，高羊茅品种“Rebel”[18]、“Rebel 3D”[19]和多年生黑麦草品种“Birdie Ⅱ”[20]等。Czembor等[21]对波兰地区采集的144份不同生态型的草地早熟禾材料进行抗锈性评价，筛选出31份对锈病具有高抗性的材料。Welty和Barker[22]调查了20多个高羊茅品种的抗秆锈(P.graminissubsp.graminicola)性状，发现一些品种在人工接种和自然感染的条件下，对锈病均表现出一定的抗性反应。他们将这些品种被保留下来，作为培育抗锈品种的基础群体。Studer等[23]利用温室人工接种锈病病菌以及叶片片段检验(LST)2种方法，对多花黑麦草(L.multiflorum)材料的抗冠锈病(P.coronataf.sp.lolii)性状进行了鉴定，将结果与大田调查进行比较发现，三者间具有高度相关性，因此认为2种方法都适用于冠锈病的抗性评价。

国内草坪草锈病的研究起步较晚。刘金平等[24]调查分析了西南地区60份野生扁穗牛鞭草(Hemarthriacompressa)种质的抗锈病能力，结果表明，参试材料的抗锈性与来源地的海拔以及植株生殖枝比例呈显著相关关系，其中40%的供试材料感染锈病，而22%的供试材料表现为高抗(HR)，表明野生扁穗牛鞭草抗锈病能力有丰富的遗传基础。邱英等[25]对四川地区引种驯化的野生草地早熟禾田间自然感病能力研究后，认为筛选获得的3～4份中抗材料可用于抗病品种的进一步选育。何秋[26]在南京地区将结缕草属的日本结缕草(Z.japonica)、中华结缕草(Z.sinica)、沟叶结缕草(Z.matrella)和细叶结缕草(Z.tenuifolia)4个种种内和种间组配形成14个杂交组合，获得68份种质材料(16个亲本和52个杂交后代)。通过对这些材料在当地锈病(P.zoysiae)的发病规律和病情严重程度调查，发现大多数种内杂交后代在始病期、耐病性以及发病程度上的表现均优于亲本；而大部分种间杂交后代与亲本差别不大。通过辐射诱变处理，获得的40份结缕草种质材料在抗锈病性状上表现差异较大。表明辐射诱变对于结缕草抗锈性影响显著，但作用效果有差异。例如，同一辐射剂量处理后，有的材料(Z014)的夏孢子始发期较对照推迟了1个多月，而有的材料(Z037和Z041)的夏孢子始发期却提前了20多天。

3 抗锈病遗传机制与品种选育

3.1遗传机制 禾草与锈病的病原菌在长期的进化过程中形成了复杂的作用机制。禾草的抗锈病性状有多种类型，其表现形式、强度和机制有所不同。广义的禾草抗锈性主要包括低反应型抗锈性、数量性状抗锈性和耐锈性等几种[17]。

低反应型抗锈性也称为垂直抗锈性，是指受感染的草坪草在锈菌侵入后迅速发生过敏性坏死反应，杀死病菌或抑制其扩展。低反应型抗锈性是由少数主效抗病基因控制的，抗锈病品种不易随环境改变而发生变异，但是可因锈菌生理小种的变化而丧失抗病性。有研究[27-29]发现，不同草地早熟禾品种对秆锈病表现出从高感到高抗的不同反应型，一些草地早熟禾品种如“Newport”等，在感染秆锈病(P.graminis)后表现出过敏性坏死反应。在高羊茅[30]和猫尾草(Phleumpratense)[31]等禾本科牧草上，研究者发现了抗秆锈性是由显性单基因控制的证据。近年的研究发现，原来表现为抗秆锈病的草地早熟禾品种，如“Midnight”等在某些地方其抗锈性已经丧失[32]。这表明可能出现了新的秆锈病原菌(P.graminis)生理小种，同时也说明草坪草低反应型的抗锈性可能由一个到少数几个主效基因决定。

数量性状抗锈性的抗病评价比较复杂，涉及侵染率、潜育期、孢子堆数目和孢子堆大小以及其他因素。田间试验表明这种抗锈性是由多个微效基因控制的，在田间自然发病条件下和成株期表现得尤为明显。数量性状抗病性的表现可因环境条件不同而有较大差异，一般不会因小种区系的变化而改变，是一种较持久的抗病性。研究表明，多年生黑麦草冠锈病的抗性遗传既有质量性状抗性特征，又具有数量性状抗性特点[33-35]。Reheul和Ghesquiere[36]研究表明，多年生黑麦草冠锈病的发生受环境影响较大，抗冠锈病性状的狭义遗传力为0.46，在改进抗性方面存在较大的潜力。通过可控条件的温室内人工接种试验和田间试验相结合，目前已经命名2个抗多年生黑麦草冠锈病主效基因位点Cr1和Cr2[37]，并已定位抗病的数量性状位点(QTL)在相应的连锁群LG 1-7连锁群上[38-41]。

耐锈性是指某些品种所具有的在感染锈病时发病期迟，潜育期较长，发病率和严重度低，具有慢锈或迟锈的特点，产量损失显著低于感病品种的特性。Rose-Fricker 等[42]观察发现，感染秆锈病的6个多年生黑麦草杂交组合材料，具有潜育期长，病情发展缓慢等慢锈特点，并表现出越亲分离(transgressive segregation)的特点，表明其耐锈性可能由多个基因控制。

3.2常规育种进展 草坪草抗病品种的选育核心是室内接种及田间自然感染相结合的方法筛选抗性材料，而轮回选择和杂交育种是目前应用得最为广泛的抗病品种选育方法。通过多个抗性材料自由授粉，获得轮回选择原始群体，根据有重复的小区试验评价后代系，选出最优个体，将最优个体进行相互杂交重组形成新的群体。经过如此循环进行多轮选择，群体中优良基因的频率不断提高，最终达到改良群体的目标。

Wofford和Watson[43]通过双列杂交法(diallel cross)，测定了6个高羊茅亲本的抗冠锈性状表现，表明供试亲本的特殊配合力具有显著差异，抗性具有非加性基因作用。通过在由多个高羊茅种质材料组成的混合群体中进行一轮混合选择，发现地中海种质材料具有较高的抗性，这些材料抗锈性性状的遗传力范围为0.07～0.52，而且不同的种质群体具有不同的抗性基因组成。Barker和Welty[44]选用对秆锈病具有抗性的20株草坪型高羊茅，通过多元杂交(polycross)和开放性授粉所得的后代群体共120株材料，通过2次轮回选择，人工接种后在可控环境中进行抗秆锈病性状鉴定，抗性植株由6%提高到50%，释放了抗锈病高羊茅种质‘ORTFRR-T94’[45]，而其抗锈性改良增幅的74%～89%是经第1轮多元杂交选择后达到的，表明高羊茅对秆锈病的抗性可能取决于少数主效基因。

根据以上研究可见草坪草抗锈病的有利基因在第1轮选择中就可以得到有效累积，通过少数几次轮回选择就可能获得优良基因频率较高、优良基因型集中的改良群体。Meyer等[46]将多年生黑麦草抗秆锈种质引进至草坪型黑麦草中，经过4轮抗锈性选择，获得了6个较亲本抗性有显著改进的新育种材料。Roderick 等[47]通过回交选择，成功将草地羊茅(F.pratensis)中的抗冠锈基因转入二倍体多花黑麦草中，这一结果在染色体水平上也通过原位杂交得到了验证。

3.3分子标记技术在抗锈病育种中的应用 传统育种技术在草坪草抗锈性改进方面取得了显著进展，由于草坪草大部分为异花授粉植物，群体相对杂合度高，遗传来源较为复杂，根据表现型进行抗锈病性状的选择，在一定程度上受环境等因素的影响。分子标记是基于DNA水平上遗传多态性的遗传标记，由于分子标记选择不受环境条件的影响，所以能够用较小的群体和以较少的世代选择理想的基因型，提高育种工作的效率。

近年来随着分子生物学的发展，RAPD(random amplified polymorphismic DNA)、SSR(simple sequence repeats)、AFLP(amplified fragment length polymorphism)等基于PCR的DNA标记技术的出现，为育种者提供了由传统的表现型选择转变为基因型分析的辅助育种技术。通过建立作图群体，利用分子标记技术检测DNA多态性，分析相应染色体座位上的分子标记所提供的遗传多态性信息，可以构建分子标记遗传连锁图谱。利用一种物种的DNA标记对另一种物种进行遗传比较作图(comparative mapping)，可揭示不同物种基因组或基因组区域共线性(synteny)的存在，从而了解不同物种基因组结构的相似性，可见比较作图的研究可显著增加物种中可供利用的遗传标记数量[48]。目前，分子标记技术已逐步应用于草坪草的抗性育种当中，通过建立遗传连锁图谱，与农作物等研究得较为深入的物种进行比较作图研究等都是草坪草抗病育种的重要发展方向。

目前，有关黑麦草属牧草抗冠锈病的数量性状位点定位与分子标记辅助育种已取得较为深入的研究。Studer等[23]通过对双向拟测交法(two-way pseudo-testcross)构建包含306个植株个体的多花黑麦草作图群体，经过田间抗冠锈性评价，并依据包含368个AFLP和SSR标记的连锁图谱，进行了抗冠锈病QTL位点分析。结果表明，有2个抗冠锈病性状相关的QTL位点分别位于连锁群LG1和LG2上，两者共同可以解释56%的表现型变异，同时筛选出了与抗冠锈基因紧密连锁的分子标记，为今后分子标记辅助选择育种提供了潜在的标记。Armstead[49]通过回交渐渗法，将二倍体草地羊茅的抗冠锈性状转入感锈病的四倍体多花黑麦草背景中，之后再通过回交转入感锈病的二倍体多花黑麦草背景，利用应用AFLP及STS分子标记作图，将抗冠锈病遗传位点定位在5号染色体末端，通过对比图谱分析发现该羊茅/多花黑麦草基因组与水稻(Oryzasativa)的第11、12号染色体具有遗传保守性，并进一步识别了与抗冠锈基因共分离的STS标记。Dumsday等[38]应用11个SSR分子标记将一个多年生黑麦草抗冠锈病主效基因的位点定位于连锁群LG2上，命名为LpPc1 (LoliumperennePucciniacoronataresistance 1)，该抗性基因位点在2个亲本群体后代中表现出遗传分离特点，分别解释一个亲本(Vedette6)80%的表现型变异，另一个亲本(Victorian9)26%的表现型变异。Muylle等[41]应用AFLP标记与群分法识别了2个有效的基因组区域，一共可以解释35%的表现型变异，其中一个AFLP标记区域位于连锁群LG2上，可以解释6.1%的表现型变异；另一个标记区域位点在连锁群LG2以外，具体位点还不确定，可以解释27.7%的抗病表现型变异。因确定的2个AFLP标记位点仅能解释小部分的抗病表现型变异，Muylle等[50]认为在所采用的抗病性分离群体中，还存在其他基因组区域与抗病性状有关。Muylle等[50]利用包含252个单株的多年生黑麦草作图群体，采用双向拟测交方法，构建了一个具有227个分子标记位点(RFLP，STS，AFLP和SSR标记)总图距为744 cM的连锁图谱。通过遗传连锁图谱进行QTL分析，发现有4个遗传区域与冠锈病抗性有关，其中2个位于LG1(LpPc4和LpPc2)上，2个位于LG2(LpPc3和LpPc1)上，分别能解释12.5%、24.9%、5.5%和2.6%的抗锈病表现型变异。同时，通过与禾谷类作物的比较基因组学方法分析表明，多年生黑麦草的LG1和LG2连锁群与燕麦(Avenasativa)的A和B染色体，以及小麦1号染色体组具有同源性，其中燕麦A和B染色体上具有抗冠锈病的基因位点，小麦1号染色体上具有叶锈病基因位点。Schejbel等[51]也通过双向拟测交法构建包含184个基因型的多年生黑麦草作图群体，并通过2年的田间性状观测、室内离体叶片病原菌接种检验(LST)以及2种方法相结合评价抗冠锈病性状，3种方法测定抗冠锈病性状的广义遗传力分别为0.42、0.56和0.64。共识别了位于LG1，LG4和LG5连锁群上的抗冠锈病QTL位点6个，但这些位点对表现型变异的解释较小，为6.8%～16.4%，表明该研究所采用的作图群体中缺失抗冠锈病的主效基因。由以上研究结果可以看出，多年生黑麦草抗冠锈病基因连锁标记位点的数量、在连锁群当中的位置和解释表现型变异的大小都与所采用的分离群体、群体大小和标记密度等存在密切的关系。

4 问题与展望

草坪基于其独特的生态、社会、景观、美学和经济等功能，越来越被重视并显示出其巨大的发展势头和潜力。草坪草绝大多数为多年生的植物，由于种类的相对稳定和大面积种植给病害的流行制造了有利的机会，随着我国草坪业的兴起，草坪规模的扩大，草坪病害研究和防治工作日趋重要[52]。现在国内外对草坪草锈病已有不少研究报道，并采用多种育种手段进行抗病育种，选育出不少坪用品质优异、抗病性较强的品种。但是与主要农作物如小麦(Triticumaestivum)、玉米(Zeamays)、燕麦等抗锈育种研究相比，草坪草抗锈病性状的研究还需在广度和深度上进一步加强。

目前国内对于草坪草锈病的研究报道较少，且研究方向多集中于病原物鉴定、症状、发病规律、发生区域和防治方法等基础调查方面，抗锈育种研究在国内还鲜见报道。国外对于草坪草锈病的研究多集中于多年生黑麦草冠锈病上，并对其抗病遗传机制和抗病基因的筛选及定位做了大量工作，为今后草坪草锈病研究打下了很好的基础。

我国地域广阔，气候条件差异大，草坪草种质资源十分丰富，对我国草坪草资源进行抗锈性调查，筛选和收集来源丰富的抗锈种质资源，是草坪草抗锈新品种选育的基础。草坪草锈病的病原菌生理小种及专化型有待进一步深入研究，通过研究草坪草锈菌的致病性分化，对锈菌的抗锈性生化机制深入了解，包括寻找抗锈基因的初级产物和解释寄主与锈菌间的特异性识别作用等，选用合适的手段深入开展草坪草抗锈育种。随着新的病原生理小种的出现，植株材料原有的抗源可能丧失抗病性，应不断地寻找新的抗性种质材料，丰富抗源类型，用抗源的多样性保持病原变异的稳定性。另外应该注重对数量性状抗性的研究，通过聚合多个抗锈基因，使草坪草能够维持长期稳定的品种抗锈性。

由于传统的育种手段受到草坪草复杂的遗传背景以及环境、生长期等条件限制，选育抗病新品种时间长，效率低。而一些分子生物技术已应用到草坪草育种当中，几种主要的草坪草都已构建了遗传图谱[53-54]。因此，可以在此基础上进行抗锈基因的筛选和定位，同时随着功能基因组学和比较基因组学的发展，也可以借鉴其他属种植物研究中的成果来推动草坪草抗锈机制、抗锈育种的研究。利用目标性状基因与分子标记之间的紧密连锁关系进行间接的分子标记辅助选择(marker-assisted selection)，在定位目的基因构建群体时做到既是遗传群体又是育种群体，使基因定位于标记辅助选择相结合，不受其他基因效应和环境因素的影响,同时又可避免等位基因间显隐性关系的干扰，获得可靠的选择结果，从而大大缩短育种周期，提高优良品质育种效率。

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