PCR-SSCP技术研究现状

张 利，黎晓敏

（西南大学动物科技学院，重庆 400715）

随着分子生物学技术的发展，检测基因结构和突变的方法不断涌现，尤其是聚合酶链式反应（PCR）技术问世以后，各种与PCR相结合的基因检测技术进一步推动了基因研究的发展。PCR是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。单链构象多态性分析技术（SSCP）是一种DNA单链疑胶电泳技术，是以构象为基础检测基因组中单核昔酸变异（是指基因组中单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换、插入及缺失等形式）的方法。PCR-SSCP技术则是PCR技术和SSCP技术的结合，是现代遗传学研究中用于检测基因点突变和短序列缺失与插入的一种工具，其是利用不同构象单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中泳动速率的差异快速有效地检测出DNA短片段中存在的单核苷酸突变，同时PCR-SSCP技术也被用于DNA定量分析，监测PCR诊断实验中的交叉污染情况以及传染源的调查等[1]。

1 PCR-SSCP技术的发展历程

SSCP技术的建立，最早可以追溯到1984年，日本学者金泽等对获得正常和F1-ATPase突变基因的大肠杆菌，酶切后进行电泳分析发现含点突变的DNA小片段在中性聚丙烯酰胺凝胶中的单链电泳迁移率与相应正常的DNA小片段的单链电泳迁移率明显不同[2]。1989年，日本学者Orita等将此法用于检测复杂基因组中单拷贝DNA中的多态现象，研究发现单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，当有碱基发生改变时，会或多或少的影响其空间构象，从而空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受到的阻力不同而导致电泳速度不同[3]。随后的研究中，Orita又将SSCP技术用于检查PCR扩增产物的基因突变，从而使得分析变得更加灵敏，并且在原来的基础上省去了酶切等步骤，进而改进了SSCP技术[4]。Ainsworth等成功地把银染技术用于PCR-SSCP分析[5]。并且日本学者Hoshino等在1992年也将同位素标记法改为敏感的银染法，增强了安全性，使得方法简便、快捷[6]。此后，Maruya等建立了PCR-LIS-SSCP技术用于HLA分型，Iwahana等用MF-PCR-SSCP检测人类K-ras突变，毛细管电泳技术与SSCP相结合用于同源和异源点突变的检测等都是PCR-SSCP技术的改进和发展[7-8]。

SSCP技术值得注意的改进是将DNA-SSCP分析改为RNA-SSCP分析，原因是RNA有更多精细的二级构象，对单个碱基的突变很敏感，使得检出率提高；而且RNA不易结合成双链，可以较大量的进行电泳，有利于染色，只是该方法增加了一个反转录过程，需要一个较长的引物，内含有启动RNA聚合酶的启动序列，从而相对增加了难度。为了进一步提高检出率，SSCP分析逐步发展为与其他突变检测方法相结合，特别是与杂交双链分析（Het）法结合大大的提高了检出率，可以使点突变的检出率接近100%。

2 PCR-SSCP技术的原理及操作过程

PCR-SSCP是一种简单、有效、快捷、廉价的检测少量基因组DNA或cDNA突变的技术，是近年发展起来的一种基因分析方法。其是以构象为基础检测基因组中单核昔酸变异（SNP），是继第一代作图用分子标记（RFLP）、第二代作图分子标记（微卫星标记）之后的第三代作图用分子标记方法之一，也是目前广泛应用于分析分子种群生物学特征、遗传性疾病检测及特定功能基因或片段分型等的标记方法之一。该方法的基本原理是经PCR扩增的目的片段在变性剂或低离子浓度下经高温处理使之解链并保证在单链状态下，然后在一定浓度的非变性聚丙稀酰胺凝胶中电泳，单链DNA迁移率除与DNA浓度有关外，更主要取决于DNA单链所形成的空间构象即单链DNA的迁移率是序列依赖性的。相同长度的单链DNA，可以因其顺序或单个碱基差异，所形成的空间构象就会不同，其在凝胶中泳动速度不一样，从而显示出带型的差异即多态型[9-10]。

PCR-SSCP技术是PCR技术与SSCP技术的结合，其操作过程是PCR扩增靶DNA；将特异的PCR产物变性，而后迅速冰浴，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子；将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果。若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变。

PCR-SSCP技术可以检测任何（包括已知的和未知的）DNA位点上的多态性和突变，但适合于检测小片段的DNA片段，片段长度要求＜500 bp，100～300 bp的片段最适合于PCR-SSCP分析，因为DNA过长，单链形成稳定的发夹结构的机会较少。当片段为200 bp时，单个碱基突变的检出率高于90%，当片段为400 bp时，单个碱基突变的检出率为80%以上，随着DNA片段的长度加大，其检出率逐渐降低[11]。

3 PCR-SSCP技术的研究现状

PCR-SSCP技术作为一种分子生物学技术日渐得到发展和完善，如今在多个领域中得到广泛应用，人医上用于癌基因和抑癌基因突变的检测、连锁反应及基因作图等，在兽医临床上也越来越多的应用该技术进行细菌种鉴定、细菌耐药基因突变检测、遗传疾病基因突变分析等。

宋薇薇等通过分离肺结核患者痰中的DNA，采用PCR-SSCP分析检测出绝大部分耐多药结核病的耐药基因，其中rpoB、katG、rpsL基因突变与结核杆菌对′RFP、INH、SM耐药性有关，与传统L-J药敏实验相比更敏感和快速，从而探讨了PCR-SSCP技术作为新的药敏方法在临床上的应用价值[12]。郑东钧等应用PCR-SSCP结合RFLP技术检测葡萄球菌的gyrA基因突变及norA基因，快速准确地检测多种细菌gyrA基因中1个或多个碱基的差异[13]。这些都是将PCR-SSCP技术应用于基因突变检测。

在细菌种快速、准确诊断中，杨文敏等应用PCR-SSCP技术对5种食源致病菌进行了16S rRNA的单链构象多态性分析，发现该方法有助于食物中毒致病菌的快速检测[14]。蔡畅等应用该方法进行鸭疫里默氏菌（RA）16S rRNA基因的单链构象多态性分析，为其分类鉴定提供了分子指标[15]。

兽医临床上也将PCR-SSCP技术用于寄生虫研究，主要是寄生虫分类学研究、虫种（株）的鉴定等方面。Li等以核糖体DNA第2内转录间隔区（1TS-2）作为遗传标志，用PCR-SSCP分析成功鉴别了两种不同的猪结节虫第3期幼虫[16]。Lin等以PCR-SSCP方法为基础，通过描述体内的核糖体DNA转录区，描绘出了中国猪的结节线虫属性状特征图[17]。很多研究者也用该方法用于病毒的分型及变异，监测PCR实验中的污染情况、病原体传播途径的研究。

PCR-SSCP技术也被广泛应用于检测引起各种遗传病的基因突变，分析群体遗传、基因分型等，揭示遗传基因演化规律。李根银等试验表明，应用PCR-SSCP技术对5个猪种DECR1基因外显子2单链构象多态性进行群体遗传学分析，探讨了猪种的群体遗传平衡状态即稳定性[18]。陈杰等应用该方法对猪的FSHβ亚基位点进行研究，发现其可以作为高繁殖力选择的遗传标记[19]。

4 小结

PCR-SSCP技术自建立以来，已广泛用于分子生物学的各种领域，而且正在发挥着巨大的作用，特别是在遗传性疾病基因突变分析、病原微生物鉴定中得到越来越多的应用，可以和DNA指纹技术、RFLPs技术相互结合在遗传资源的调查中发挥作用，从而为利用遗传资源提供理论依据。在不久的将来，PCR-SSCP技术在遗传变异研究中将会得到更为广泛的应用和发展。

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