人Parkin基因重组质粒的构建

李普阳,夏学巍＊,李 勇,张 伟

(1桂林医学院附属医院,广西桂林 541001;2桂林医学院)

研究发现[1],在帕金森病(PD)患者的黑质中存在泛素—蛋白酶体途径(UPP)的功能异常,这可能是PD发病的核心机制。Parkin、DJ-1等作为泛素蛋白的配体,对细胞可起到保护作用。2008年 9月 ～2010年 5月,我们应用分子生物学技术构建了人Parkin基因重组质粒,旨在为PD的基因治疗用于临床奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 总RNA抽提试剂Trizo1,RT-PCR试剂盒。引物由上海生工公司合成,上游为(Cla I)5′-CCATCGATCCACCTACCCAGTGACCA-3′,下游为(Xba I)5′-GCTCTAGACCCATACAGATACATGGATTGCA-3′;克隆载体pUCm-T,菌株DH5α;限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶。

1.2 方法

1.2.1 胎儿黑质组织的获取及其总RNA的提取从 18周自然流产男性胎儿提取黑质组织(由临床医院捐赠,并经家属签署知情同意书),研钵中加入液氮研磨组织块;取50～100mg,加入1 ml Trizol匀浆,冰上静置5min。加入200μl氯仿,震荡15 s,静置2 min。4℃12 000 g离心15min。取上清,加入500μl异丙醇,将液体混匀,冰上静置 10 min。4℃12 000 g离心10min。弃上清,加入75%乙醇1 ml,洗涤2次。4℃7 500 g离心 5min,弃上清。晾干后,加入 100μl DEPC中,65℃孵育促溶 10～15 min。

1.2.2 目的cDNA片段的获取 冰上配置RT反应液,5×Prime Script Buffer 2μl,Prime Scrip t RT Enzyme MixⅠ0.5μl,Oligo dT Primer(50μM)0.5 μl,Random 6mers(100μM)0.5μl,总RNA 500 ng,加RNase Free dH2O水至10μl,37℃15 min进行逆转录反应,85℃5 s使得反转录酶失活。扩增目的基因:冰上配置PCR反应液,SYBR Premix Ex TaqTMII(2×)12.5μl,PCR Forward Primer(10μM) 1μl,PCR Reverse Primer(10μM)1μl,RT反应液2 μl,灭菌蒸馏水 8.5μl,总体积为25μl。95℃变性1m in,61℃退火1min,72℃延伸3min 30 s,10个循环。95℃变性1 min,59℃退火1min,72℃延伸3m in 30 s,10个循环。95℃变性1 min,57℃退火1min,72℃延伸3min 30 s,10个循环。95℃变性1 min,58℃退火1min,72℃延伸3min 30 s,5个循环。72℃充分延伸 10 min。4℃终止反应。

1.2.3 重组质粒的构建 取PCR产物0.1μg,10 ×Taq DNA聚合酶1μl,PCR缓冲液1μl,5mmol/ L dATP 0.4μl,Taq DNA聚合酶(3U/μl)0.1μg,加去离子水至总体积 10μl,充分混匀。混合物于70℃孵育1 h。取加A尾PCR产物0.2 pmol,1μl pUCm-T载体,1μl 10×ligation Buffer,1μl 50% PEG,最后加入1μl T4 DNA Ligase,补充去离子水至10μl,充分混匀,20℃连接1 h。

1.2.4 连接产物的转化及筛选 取 100μl感受态细胞,置冰上。完全解冻后将细胞均匀悬浮。加入5μl连接液混匀,冰上放置30min。42℃热休克90 s,冰上放置15～20 min。加入400μl SOC培养基, 37℃200～250 r/min振荡培养1 h。室温下4 000 r/m in离心5 min,吸掉400μl上清液,用剩余的培养基将细胞悬浮。将细菌涂布在预先用20μl IPTG和100μl X-gal涂布的氨苄青霉素平板上,37℃下正向放置1 h,然后倒置培养过夜。选择在平板上生长的白色菌落,用牙签挑至含氨苄青霉素的液体培养基,37℃培养过夜。

1.2.5 重组质粒的酶切鉴定及测序 随机挑取白色菌落,接种于2 ml含氨苄西林(50 mg/L)的LB培养基中,振荡培养;小量提取质粒,用XbaⅠ和ClaⅠ酶切检测,琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察酶切结果。送上海生工公司用M13通用引物和T7启动子引物对PCR产物进行测序。用ABI 100 Model 377自动测序仪进行全序列测序。

2 结果

2.1 总RNA提取结果及RT-PCR扩增产物 提取出总RNA后,测OD值。OD值介于1.8～2.0,RNA提取质量较好。在紫外灯下观察总RNA电泳,可见28 S、18 S和5 S三个条带,28 S和18 S亮度之比为2∶1,5 S条带较弱,说明 RNA无降解。逆转录得到cDNA第1链,用合成的Parkin上、下游引物进行PCR反应,得到约 1 785 bp的特异性片段,初步鉴定为人Parkin cDNA。

2.2 PCR产物的克隆的鉴定及测序结果 用XbaⅠ和ClaⅠ酶切可见有1 778 bp,初步鉴定提示有Parkin cDNA的插入。挑选阳性克隆在自动测序仪下测序,结果经Medline Blast查询,与Gene Bank [NM 004562]所登录序列完全一致。

3 讨论

Parkin基因定位于6q25.2～27,位于遗传标记D6S305和D6S253之间。全长1.5 Mb,有12个外显子,编码序列为1 395 bp,所编码蛋白含465个氨基酸。其是泛素和蛋白的 E3连接酶,能与 E2 UbcH7和UbcH8共同作用,而且Parkin自身也是经泛素化调节降解。Parkin编码蛋白在正常人的脑部广泛表达,特别是黑质区,而PD患者脑内缺乏Parkin蛋白表达;一旦Parkin变性,可影响某些蛋白降解,从而引起多巴胺类神经元的毒性损伤,导致常染色体隐性少年型帕金森病(ARJP)[2]。Parkin蛋白作为一种泛素—蛋白连接酶参与蛋白降解[3,4]。一般大脑中的Parkin蛋白并不以天然的α-synuclein为底物将其泛素化,而是与结构上发生改变的 αsynuclein蛋白,如翻译后加工的(O端糖基化或磷酸化)、构象改变的(原纤维的纤维化或多聚化)发生作用。Parkin基因突变常导致Parkin蛋白缺失,功能障碍,酶活性减弱或消失,造成细胞内异常蛋白累积,最终导致多巴胺能神经元死亡[5,6]。所以,Parkin蛋白在泛素—蛋白水解酶复合体通路中发挥重要作用,是一种多用途的神经保护剂。

本实验扩增到的特异性片段约为 1 395 bp,与预期片段太小相符;连接入克隆载体后,经Pst I酶解,与片段内部酶切位点相符,初步鉴定为Parkin cDNA。测序结果表明该片段与Gene Bank报道完全相符,故可确认为Parkin cDNA。此外,在合成引物时加入的Cla I和Xba I酶切位点对今后亚克隆提供了基础,pUCm-T载体具有T7启动子,可用来合成原位杂交的探针,为今后的工作奠定基础。

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