饲料呕吐毒素生物降解研究进展

王金全 中国农业科学院饲料研究所，北京 100081

呕吐毒素(Vom itoxin)，又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxyniva1eno1,DON)，是一种无色针状结晶,熔点为151-152℃,具有较强的热抗力,121℃高压加热25 m in仅少量破坏。呕吐毒素是由镰刀菌属（Fusarium）产生的毒性代谢产物，属于单端孢霉烯族化合物(Desjardins,2006)图1。镰刀菌属通常在作物生长期间就被污染，其最适生长温度为5～25°C，最适生存环境为长江以北大部分地区。呕吐毒素多分布于小麦、大麦、玉米等谷物籽实中。在谷物和饲料中检出率极高，是在黄曲霉毒素之后污染最严重的霉菌毒素。

图1 基本结构Basic structure of trichothecenes(R1,R2,R3,R4和 R5可以为-H,-OH,-OAC,-COCH2CH(CH2)2,或 =O 的功能集团)，(Cole and Cox,1981)

呕吐毒素对人和动物均有很强的毒性，12，13-环氧基团是呕吐毒素的毒性结构（图1），能引起人和动物呕吐、腹泻、皮肤刺激、拒食、神经紊乱、流产、死胎等(Desjardins,2006;Eriksen et a1.,2004;Morgavi and Ri1ey,2007)，猪是对呕吐毒素最敏感的动物，家禽次之，反刍动物由于瘤胃微生物的作用，耐受力最强。对生长肥育猪而言,含有14 ppm 呕吐毒素的饲料饲喂后10～20m in即会出现呕吐、不正常的焦虑和磨牙现象。在含毒量10 ppm以上即完全拒食 (Trenho1m等,1994;W i11iams等,1988)。

呕吐毒素具有很强的细胞毒性,它对于原核细胞、真核细胞、植物细胞、肿瘤细胞等均具有明显的毒性作用。它对于生长较快的细胞如胃肠道黏膜细胞、淋巴细胞、胸腺细胞、脾细胞、骨髓造血细胞等均有损伤作用，呕吐毒素可能通过3种不同的方式对原核细胞产生毒性作用∶（1）通过渗透磷脂双层,作用于亚细胞水平;（2）通过与细胞膜相互作用;（3）通过自由基介导的脂质过氧化作用。

呕吐毒素是一种免疫抑制剂,它能抑制蛋白质和DNA、RNA的合成，抑制线粒体的功能，阻止细胞分裂和膜的功能，呕吐毒素通过其倍半萜烯结构抑制转录、翻译过程，产生免疫抑制作用。(Azcona-O1ivera et a1.,1995;Ne1son,2002;Eriksen et a1.,2004;Pestka and Smo1inski,2005;Rocha et a1.,2005;Stark,2005;Zhou et a1.,2005a)

1 呕吐毒素的污染状况

1.1 世界范围内的污染情况

据报道，全球生产的饲料中至少25%污染了已知的霉菌毒素。联合国粮农组织估算，全世界由于霉菌毒素污染造成的损失，每年达数千亿美元，而对人畜引起的危害更是难以统计。（计成,2008，2009）。

BIOM IN GmbH与新加坡罗马实验室(Romer Labs Singapore Pte Ltd.)从2007年10月至2008年9月合作实施霉菌毒素普查项目，共进行了5192项对农业和畜牧业来说最重要的几种霉菌毒素--黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZON)、呕吐毒素(DON)、烟曲霉毒素B1(FUM)和赭曲霉毒素A(OTA)的检测。分析的样品有玉米、小麦、大米，有加工副产物如豆粕、玉米蛋白粉、DDGS，以及一些草料如秸秆、青贮和全价料，总数为1086份。结果显示，所有的检测样品中，AfB1、ZON、DON、FUM 和 OTA的阳性污染率分别为31%、46%、54%、54%和19%。所分析样品的50%来源于北亚区域，而且大多数来源于中国大陆。与上年度相似，北亚区样品中DON的发生率非常高，76%的样品呈阳性(平均含量873ppb)。本次普查所发现的最高DON含量(32893ppb)样品为来源于中国的全价料样品。（DI Ines Rodrigues.2009）

值得我们关注的是，近年来，玉米作为原料发酵酒精的用量越来越大，随之产生的大量的副产品蒸馏干燥玉米酒糟(DDGS)，也正在被普遍的应用到饲料中，然而，霉菌毒素污染成为使用DDGS的巨大障碍，这是因为酒精发酵的过程不但不会破坏霉菌毒素，最终的DDGS反而会使霉菌毒素浓缩2～3倍。 （Zhou,2007,内部资料）

1.2 中国呕吐毒素污染现状：

农业部饲料质量监督检验测试中心 (成都)2008年从全国七大区域中选择一些有代表性的省份(辽宁，河北，河南、湖南，广东，福建、江西、山东，四川、贵州以及陕西)的饲料和养殖企业采集了7种主要饲料原料(玉米、豆粕、菜粕、棉粕、小麦、小麦麸、鱼粉)及2种主要配合饲料，共计1018个样品。呕吐毒素平均检出率为95.8%，超标率呈现北高南低的趋势，平均为18.7%。

表1 我国主要饲料原料及产品中呕吐毒素污染情况与分布规律

国家粮食局标准检测中心2009年6月对河南、湖北两省13个地市的小麦400份样本检测。黄曲霉毒素检出率18.3%，未超标。呕吐毒素检出率46%，其中16.2%超标，玉米赤霉烯酮检出率37.1%，其中12.4%超标。

2 呕吐毒素的生物降解

目前为止，没有更有效的方法解决霉菌毒素污染的问题，常用的脱毒方法是将污染的饲料原料按照比例稀释或向饲料中添加霉菌毒素吸附剂（沸石或者膨润土）。但是这些方法都存在着各自的缺陷。稀释法容易造成二次污染，吸附法的缺点是吸附剂没有选择性，而且对营养物质的吸附要大于霉菌毒素。通常，吸附方法对那些具有极性基团并且其极性基团处于适当位置，很容易被吸附的霉菌毒素有效（黄曲霉毒素）。但是，很多毒素比如单端孢菌霉烯毒素(呕吐毒素、T-2毒素等)、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素等，不能被完全吸附。此外，吸附脱毒的效率很大程度上取决于环境pH值。

生物降解由于其有效性、针对性和环境友好性，将是未来霉菌毒素脱毒的一种趋势。酶解脱毒是控制饲料霉菌毒素风险的有效方法，可以解除很多不能被吸附脱毒的霉菌毒素。通过使用酶或者活菌(产生脱毒的酶)来改变毒素的结构，将毒素转化成为对动物无毒的物质。

目前，有关黄曲霉毒素生物降解的研究相对较多。刘大岭，姚冬生等人1997年发现从真菌假密环菌(Armi11arie11a tabescens)中提取的粗酶液可使样品中的黄曲霉毒素含量减少80%。证明了起解毒作用的是一种胞内酶，该酶催化温度20～30℃，解毒后产物无毒，Km值为2.16×10-6mo1/L。随后，他们从该真菌的菌丝提取物中分离纯化出此解毒酶团，克隆得到其基因序列并成功转化到毕赤酵母表达系统中，还对该酶的固定化技术进行了研究。

计成的研究小组2006年开始应用香豆素从动物粪便、发霉粮食和饲料、土壤等54个样品中得到199株细菌，再用黄曲霉毒作底物进一步筛选，得到26株有降解活力的菌株，对其中降解活性大于75%的9株菌进行形态学观察和16SrDNA鉴定。进一步研究发现一种能够降解黄曲霉毒素的新型活性蛋白-黏细菌黄曲霉毒素解毒酶，并证明是一种胞外酶。目前，黄曲霉毒素生物降解的研究还存在诸多需要解决的问题，如酶解后产物的化学结构还不明了，无法定性黄曲霉毒素解毒酶的解毒效率，生物发酵法生产的解毒酶的活性不高等问题。微生物降解呕吐毒素早在1960's被发现 (Horvath and Varga,1961)，此后，从动物肠道、土壤和植物等不同来源得到的的微生物混合物被证明能够降解霉菌毒素 (Yoshizawa et a1.,1983;Kiess1ing et a1.,1984;Swanson et a1.,1988;Beeton and Bu11,1989;He et a1.,1992; Ko11arczik et a1.,1994;Matsushimaet a1.,1996;Vo1k1 et a1.,2004)。Zhou（2007）总结了历年来所有能够降解呕吐毒素的微生物种类（表2）。

呕吐毒素DON可以被微生物降解成毒性很低的化合物，12，13-环氧基团是呕吐毒素的毒性结构，去除这种环氧基团就能显著降低其毒性，比如DON 就可 以降 解为 DOM-1（图 3， 图 4）。Yoshizawa等在小鼠的尿液和粪便中发现，呕吐毒素的环氧基团在酶的作用下发生去环氧化反应，生成二烯。但是此项研究进展一直是很艰难的，原因是很少有人分离出具备解毒活性的单独菌株。Binder等在2000年提纯出能够将呕吐毒素的环氧结构进行生物转化的细菌品系，他们从瘤胃内容物中分离到能够将呕吐毒素进行转化脱毒的混合活菌群，进一步分离出所需要的菌株，命名为BBSH797。但是据后来Zhou等对该产品的评价表明（内部资料），该产品的解毒作用不理想，原因可能是因为微生物来源于瘤胃，不适合于在家禽和猪的肠道中生长。最近Zhou等改进分离方法，再次确认呕吐毒素可以被家禽肠道微生物所降解(Gong et a1.2003;Zhou et a1.2005b)，并成功分离到能够降解呕吐毒素的菌株。近几年，分离能够降解呕吐毒素的微生物细胞或者酶引起了科学家的兴趣，关舒等（2009）从catfish的肠道内分离到降解呕吐毒素的菌株C133，该菌株在低温环境4～25°C下活性最高，活性最适pH范围是4.5～10.4。Hai等（2010）采用常规分离和PCR-DGGE相结合的方法，从蛋鸡的肠道内分离出能够降解呕吐毒素的菌株。目前，进一步的研究集中在降解呕吐毒素的解毒酶的分离和纯化方面，以及寻找产解毒酶基因，然后将目的基因克隆到生物表达其中高效表达，这将是今后一段时间霉菌毒素生物降解的研究方向。

图3 .呕吐毒素 Vom itoxin被微生物转化成毒性很低的毒素de-epoxy vom itoxin (DOM-1)（Gong,2003）。

表2 能够降解呕吐毒素的微生物/混合物（Zhou,2007）

图4 .HPLC检测呕吐毒素降解前后产物图谱

近年来，霉菌毒素污染对畜牧生产的负面影响逐渐被人们认识，尤其是呕吐毒素在我国谷物及饲料产品中检出率和超标率都居高不下，是我国北方粮食主产区的主要污染毒素。国外对于呕吐毒素的研究刚刚起步，在中国，还没有见到呕吐毒素降解菌以及解毒酶相关的研究报道，筛选出能够产高效降解呕吐毒素酶的菌株以及通过酶工程、基因工程等手段获得高效表达的解毒酶是当前研究的方向。参考文献(略)