情绪应激后大鼠颞下颌组织学及关节盘内P物质的相关变化*

吴高义 陈 磊 司武俊 王昭领 朱国雄

颞下颌关节病(temporomandibular disorders，TMD)病因复杂，与咬合、情绪等因素密切相关[1]。但因建模困难，指标不易量化等原因，情绪因素与TMD的相关研究鲜有报道。近年来研究发现，感觉神经通过其末梢释放神经肽类物质，与关节软骨的代谢有密切的关系[2,3]，其中P物质(substance P，SP)广泛分布于TMJ中，在实验诱导下的TMJ病变的发生、发展中起重要作用[4]。因此，本实验运用交流箱动物模型，通过观察情绪应激后的大鼠TMJ内SP的表达情况，进一步了解情绪应激与TMD关系。

1.材料及方法

1.1 材料 SD大鼠，三级，90只，体重120 g±20g，由第四军医大学实验动物中心提供编号SCXK(军)2002-005，雌雄对半。

实验用大鼠交流箱(由第四军医大学教保中心制)，电刺激发生仪(由第四军医大学物理教研室提供，直流电刺激电压48伏，刺激频率0.5赫兹)，SP抗体(Sigma公司，美国)，SABC试剂盒和DAB试剂盒(博士德生物工程有限公司，武汉)。

1.2 实验动物分组 研究工具与测评方法见前文[5]。随机将90只大鼠分为3组，每组各30只，分别为对照组，情绪应激组(PS)和足部电击组(FS)，各组动物的体重、性别通过均衡检验，证实无差异，具有可比性，动物模型的制备和饲养条件相同。

施加刺激因素方法如下：实验开始前一周，将大鼠都放入相应的交流箱中适应，不给任何刺激，使其适应环境。实验开始后，每天上午固定时间给与FS组电击，每日30min，电压48伏，应激频率0.5赫兹(图1)，常规饲料喂养。

各组动物实验方法如下：(1)空白对照组：以无应激状态下饲养大鼠；(2)FS组：每天上午固定时间给与电击，每日30min，电压48伏，应激频率0.5赫兹；本组大鼠仅作为应激原，不作为实验观察对象。(3)PS组：通过FS组的排谢物，竖毛，尖叫等反应受到心理影响。

图1 情感交流箱示意图

1.3 实验方法 对照组、PS组动物分别在1周、3周及5周时随机选取10只取材，取材时用l0g/L戊巴比妥钠(30mg／kg)腹腔内注射麻醉，经左心室插管，先用10mL/L肝素生理盐水冲洗血液，再用40g/L多聚甲醛灌流固定，取双侧TMJ，在40g/L多聚甲醛液中固定24小时。然后在8mol／L甲酸和1mol／L甲酸钠等量混合的脱钙液中脱钙1周。流水冲24小时，常规脱水、透明、浸蜡包埋，4μm厚石蜡切片。分别行HE染色，SP免疫组织化学染色，灰度测量。

1.4 统计处理 所有数据均采取均数±标准差表示，统计方法按照重复测量方差分析，采用SPPS13.0统计软件，以P＜0.05为差异显著。

2.结果

2.1 大体观察 实验中，FS组有尖叫，跳跃，翘尾，竖毛等行为表现；PS组有竖毛，恐慌等行为表现。取材时，实验组与对照组同性别大鼠平均体重相似，各组大鼠无意外死亡。

2.2 组织学表现 单视野中P物质显阳性，主要分布在关节盘前、后带，且多分布在近盘边缘部，大多数阳性纤维由棕黑色膨体呈串珠状构成。镜下观察PS 1周组阳性纤维密度最高(图3)。对照组(图2)、PS3周组阳性纤维密度较高(图4)、PS5周组阳性纤维密度较低(图5)，但各组间差异不明显。

图2 对照组关节盘的P物质染色(×100)

图3 情绪应激1周组关节盘的P物质染色(×100)

图4 情绪应激3周组关节盘的P物质染色(×100)

图5 情绪应激5周组关节盘的P物质染色(×100)

2.3 HE染色(图6) 对照组大鼠髁状突软骨由浅入深依次分为关节表面带、增殖带、纤维软骨带和钙化软骨带。表面带由与关节面平行的胶原纤维组成；增殖带为许多密集的小细胞，即前软骨细胞组成；纤维软骨带由圆形软骨细胞组成。关节盘中央部分较薄，前后部分较厚，主要由纤维及软骨成分组成。PS组1周组可见大鼠颞下颌关节下腔可见到明显的脱落细胞，主要为滑膜细胞，髁突表面部分区域凹凸不平，表面胶原纤维水肿、松解。关节盘炎性反应明显，PS组3周时病理性变化最为明显，关节盘后带出现纤维玻璃样变、断裂，严重区部形成裂隙，PS组5周时，髁突表面部分区域凹凸不平，表面胶原纤维水肿、松解。

图6 对照组，情绪应激1、3、5周组大鼠颞颌关节HE染色)(×40)

2.4 图像分析及统计学检验 图像分析表明，P物质阳性纤维与对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)。对照组和PS1周组之间有显著性差异(P＜0.05)，对照组和PS3周组、5周组之间差异不显著(P＞0.05)。PS3周组、5周组比较1周有下降趋势，但仍然高于对照组(图7)。

图7 SP阳性纤维灰度测量标记图

3.讨论

近年来的研究发现，情绪因素(心理社会因素)与TMD的发生，发展和治疗效果有着密切的关系，甚至越来越多的学者认为TMD是一种心身疾病。学者们在研究中发现[6,7]，情绪因素如高水平应激、躯体不适、情绪障碍等在TMD的发病过程中扮演了重要的角色。本研究结果证实情绪因素对TMJ的微结构具有一定影响。

P物质与TMJ关系密切，TMJ关节囊、盘、盘周附着、滑膜及骨膜中均有P物质阳性纤维的分布[8]。P物质具有免疫调节作用，可促进肥大细胞脱落，释放组胺及5羟色胺等各种伤害性刺激因子，如创伤、压力、精神紧张和炎症介质等，可能在骨组织重建以及骨折愈合过程中起调节作用。在感受力学刺激和局部代谢状况与调节靶细胞(成骨、破骨细胞)功能之间起着联络作用[4]。P物质能够诱导滑膜细胞中DNA和蛋白质的合成与分裂，促进滑膜细胞增生形成滑膜翳，导致关节表面滑膜组织过分生长，并与已知的滑膜细胞的另两种刺激因子白细胞介素-1和肿瘤坏死因子相互作用，共同发挥对滑膜细胞的作用。在病理刺激下P物质不仅顺行传入中枢表达痛觉信息等，而且被逆行释放于局部组织中引起无菌性炎症反应，其浓度的高低与患者的疼痛密切相关[9]。本研究结果说明大鼠TMJ在情绪应激状态下发生的一系列病理性改变中，P物质神经肽可能参与了这种病理过程，并且在病变的初期可以出现明显的疼痛症状，而随着时间的延长，疼痛症状可能会有所减轻。

在临床中我们有时会发现，有些患者疼痛症状并不严重，但是，在关节镜下我们可以看到TMJ有明显的炎性组织存在，再也正好与我们的实验结果相一致。所以，对TMJ病的治疗，我们在药物治疗和手术治疗的同时，更应从机体功能紊乱和心理疾病两方面因素对TMD进行评估[10,11]。

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