灯笼草防治小鼠消化道过敏反应的实验研究

王桂桂 马延祥

食物过敏是一种较常见的变态反应性疾病，在发达国家已被视为一个主要的健康问题[1]。已有的研究表明，食物过敏轻者可引起皮肤、胃肠道过敏症状，重者可致哮喘发作、休克甚至死亡。婴幼儿期患过食物过敏的小儿，在小学时期的身高明显低于正常同龄儿[2]。由于食物过敏发病率较高，对人类健康危害性较大，研究食物过敏的病因、发生机制、临床表现和诊断措施，已成为近年国内外学者十分关注的课题，但有关应用有效药物积极防治食物过敏的研究，至今尚不多见。为此，我们应用卵清蛋白建立小鼠肠道致敏模型，观察单味中药灯笼草对小鼠消化道过敏反应的影响，探寻临床上能够有效防治儿童食物过敏的药物。

1 材料与方法

1.1 试剂、仪器与动物 卵清蛋白(ovalbumin OVA)、氢氧化铝、甲苯胺兰等（Sigma公司），IgE、ALT、ɣ-干扰素（IFN-ɣ）、白介素5（IL-5）试剂等（上海蓝基生物科技有限公司），灯笼草（延边大学医学部供应科）。所用仪器均来自延边大学附属医院检测中心实验室。生长条件相同、无鸡蛋喂养、6～8周龄，体重16～18g，BALB/C♀小鼠(SPF级，延边大学医学部)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与药物制备 将64只小鼠随机分为正常对照组（Control）、模型组（Model），灌服高、中、低浓度灯笼草预防组（YH、YM、YL组），灌服高、中、低浓度灯笼草治疗组（TH、TM、TL组）。按照传统中药煎剂制备方法，取灯笼草全草100g，加入500ml双蒸水，浸泡20min后，加热煎煮至150ml，用纱布滤去药渣，再用文火将该煎剂浓缩为100ml的浸膏，分装于无菌小瓶内，－20℃储存备用。100g生药制成100ml定为100%浓度，并将药物浓度分为高(100%)、中(50%)、低(25%)三个浓度。

1.2.2 建立0VA致敏小鼠模型 基础致敏：实验第1天，对Y组、T组和ModeL组的每只小鼠，腹腔注射含有10ug OVA及lmg氢氧化铝的无菌生理盐水0.5ml，ControL组腹腔注射等量无菌生理盐水。强化致敏：实验第15天，对Y组和Model组每只小鼠，腹腔注射含20ug OVA的无菌生理盐水0.5m1；Control组腹腔注射无菌生理盐水0.5m1。激发肠道过敏：实验第20、25、30天，分别以OVA生理盐水0.5ml(OVA浓度为50mg/ml)，对Model、Y、T组每只小鼠进行灌胃激发，ControL组小鼠同时以等量生理盐水灌胃。

1.2.3 给药 每只小鼠灌服的灯笼草水提物剂量（以下简称灯笼草），均按每次0.3ml/10g体重，每日2次，共10d，其中，Y组于实验前7天开始灌服，T组于实验开始第20天开始灌服。

1.2.4 标本采集 实验第30天，摘除小鼠眼球取血，分离血清，放入-70℃的冰箱中保存备用；取完眼球血后，将小鼠四肢固定于案板上，切开腹部皮肤并暴露腹腔组织，取十二指肠Treitz韧带以下5cm的小肠0.5cm，用冷生理盐水清洗，再浸入10%福尔马林中固定，常规石蜡包埋、切片4um，做HE染色和甲苯胺蓝染色。

1.2.5 主要观察指标 血清OVA特异性IgE水平（OD值），采用ELISA法；血清ALT（U/L）检测采用赖氏法：用UV-8500荧光分光光度剂，于波长505nm处检测吸光度，制定标准曲线，换算成ALT值；形态学观察及肥大细胞完整率采用病理显微图像分析仪进行小肠粘膜组织形态学观察与分析；随机连续计数小肠切片10个高倍视野内的肥大细胞数目，取平均值代表其密度，并同时累计肥大细胞总数及脱颗粒数。IL-5和IFN-ɣ的表达强度对小肠组织病理标本行免疫组化染色(sABC法)，参照Hayashi等标准[3]，将 IL-5和IFN-ɣ免疫组化染色切片的表达强度行半定量评分：0分（细胞未着色）；1分（浅黄色）；2分（浅棕黄色）；3分（棕黄色）；4分：（棕褐色）。

1.2.6 统计学方法 应用SPSS17.0软件，采用单因素方差和非参数统计分析。计量数据均以±s表示，多组间比较采用LSD法，P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

HE染色结果 模型组：小肠绒毛上皮细胞出现局灶性坏死、脱落，固有层明显水肿、血管充血；TH、TM、YH、YM组：小肠上皮脱落减少，炎症细胞浸润较模型组明显减轻。YL、TL组：小肠炎症程度与模型组相近。

表1 各组小鼠观察指标结果（n=8,±s）Table 1 Change of index in mice（n=8, ±s）

表1 各组小鼠观察指标结果（n=8,±s）Table 1 Change of index in mice（n=8, ±s）

注：Compared with Model group：*P＜0.01;compared with control group: ▲P＜0.01；compared with Y group and T group：■P＞0.05。注：与Model组比较*P＜0.01; 与control组比较▲P＜0.01；Y组与T组比较■P＞0.05。

Groups Integrality of mast cell (%) IgE（OD） IL-5(marks) IFN-ɣ(marks) ALT(U/L)control 84.7±6.79 0.81±0.04 1.47±0.14 1.21±0.04 39.63±3.91*Model 48.6±5.34▲ 1.01±0.03▲ 2.99±0.05▲ 2.91±0.09 79.63±6.82 YH 70.5±6.77*■ 0.86±0.02*■ 2.35±0.02*▲■ 2.33±0.04*▲■ 37.88±3.85*■YM 63.5±3.08*■ 0.87±0.02*■ 2.50±0.04*▲■ 2.43±0.05*▲■ 38.38±3.53*■YL 37.0±4.64▲■ 0.99±0.04▲■ 2.96±0.06▲■ 2.86±0.08▲■ 57.75±7.08*■TH 78.6±4.90* 0.78±0.05* 2.21±0.02*▲ 2.19±0.04*▲ 39.63±2.88*TM 65.4±4.30* 0.83±0.05* 2.33±0.03*▲ 2.28±0.05*▲ 43.00±5.99*TL 38.0±4.36▲ 0.96±0.06▲ 2.81±0.05▲ 2.85±0.06▲ 43.63±6.14*

甲苯胺兰染色结果 模型、YL、TL组：小鼠小肠固有层肥大细胞聚集，多数肥大细胞胞膜破裂，轮廓不清，并向外排除颗粒；YH、YM、TH、TM组：小鼠小肠固有层肥大细胞聚集及脱颗粒现象较模型组明显缓解。

各组小鼠观察指标结果请见表1。

各组间比较结果：小肠肥大细胞完整率（%）：模型组明显低于正常对照组（P＜0.01）；YH、YM组均明显高于模型组（P＜0.01）；但Y与T组之间未见显著性差异（P＞0.05），进一步提示高、中浓度的灯笼草，能够有效保持肥大细胞的完整，减少肥大细胞脱颗粒，且肥大细胞完整率与灯笼草的浓度有关。

血清IgE水平（OD值）：模型组明显高于其他各组（P＜0.01）；YH、YM组均明显高于模型组（P＜0.01）；Y组的IgE水平虽在数值上优于相同浓度的T组，但统计学上未见显著性差异（P＞0.05）。提示高、中浓度预防组小鼠，血清IgE水平与治疗组一样，均显著低于模型组，并接近正常对照组的水平。

小鼠肠组织IL-5和IFN-ɣ表达强度：模型组小鼠IL-5和IFN-ɣ含量均明显升高（P＜0.01）；YH、YM组均明显低于模型组（P＜0.01）；Y组的IL-5和IFN-ɣ水平在数值上也优于相同浓度治疗组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

各组小鼠ALT水平：模型组小鼠ALT水平明显升高；YH、YM组的ALT水平均明显低于模型组，差异具有显著性（P＜0.01）；相同灯笼草浓度在Y组与T组之间无显著性差异（P＞0.05）。

3 讨论

对人类健康构成威胁的食物过敏原，主要来自食物中含有的致敏蛋白质、食物加工储存中使用的食品添加剂和含有过敏原的转基因食品[4]。目前已知食物过敏的主要影响因素包括：遗传因素、喂养情况、孕期饮食及吸烟情况，但因为人类食物品种繁多，地区、季节、个人饮食习惯又各不相同，诊断和治疗都存在一定困难[5]。

以往的研究结果已证实：某些细胞因子，在食物过敏反应中起重要作用，如：血清特异性IgE水平、嗜酸性粒细胞及组胺含量、肥大细胞释放的细胞因子或直接引起胃肠效应，或活化状况（通常以肥大细胞完整率表达）、相关组织中IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-ɣ的表达[6]。因此，检测这些相关的细胞或细胞因子的含量水平，追踪观察其变化情况，对于及时诊断食物过敏性疾病和临床疗效的判定，甚至预防作用的确立，都具有较重要的意义。

IgE介导的速发型食物过敏是主要的过敏反应，其显著特征是：无害的食物过敏原间接引起特异性IgE的产生。肥大细胞参与了肠道粘膜功能的调节，脱颗粒释放的介质引起炎症反应，食物特异性IgE常常在尚未出现临床症状前就已经存在。因此，测定血清食物特异性IgE，是目前公认的食物过敏的诊断和预测方法。本实验成功建立了IgE介导的OVA过敏小鼠模型，并再次证实：模型组小鼠血清特异性IgE水平确实明显升高，肠道粘膜出现大量肥大细胞聚集、脱颗粒，绒毛上皮细胞局灶性坏死、脱落，固有层明显水肿、血管充血[7]。

灯笼草为茄科带萼果实植物，盛产于我国许多地区，民间常用于治疗咽喉肿痛、腮腺炎、肺热咳嗽、泌尿道炎症等病症，是采集服用方便、无明显不良反应的果、药两用资源[8]。已有的研究结果表明：灯笼草能够明显缓解哮喘小鼠肺和过敏小肠组织的炎症，对致敏小鼠的免疫性肝损伤具有明显的保护作用；能够降低肺组织中IL-5和IFN-r的表达，且存在明显的量效关系[9-11]。

本研究结果进一步证实，高、中浓度的灯笼草，可以明显地缓解肥大细胞聚集、脱颗粒现象，缓解小肠炎性。其中，预防组的IgE、ALT、IL-5和IFN-ɣ水平，均明显低于模型组，肥大细胞完整率明显高于模型组；预防组的IgE、IL-5和IFN-ɣ水平，在数值上优于相同浓度的治疗组；但各个观察指标在预防组与治疗组之间，均未见显著性差异。

通过复习相关文献我们认为，高、中浓度的灯笼草降低过敏小鼠IgE水平及IL-5的表达，可能通过调控过敏小鼠体内Th3等调节性T细胞亚群，进而下调体内高水平的IL-5，发挥抗过敏作用。另一方面，灯笼草也可能直接降低肠道通透性，减少了通过肠道与肥大细胞结合的OVA过敏原数量，使IL-5的表达强度明显低于激发组，从而降低小鼠发生Th2细胞优势，维持小鼠的Th2/Th1平衡状态，发挥一定的免疫调节作用。

当食物过敏反应发生时，肠道的通透性增加，仍具有抗原性的食物可被吸收，通过门静脉进入肝脏而诱发免疫反应，损伤肝脏组织。ALT主要存在于肝细胞中，其活性的高低，是肝功能受损或恢复的特异性指标。本研究发现：高、中浓度的预防组和治疗组的ALT水平，均明显低于模型组，提示灯笼草对免疫性肝损伤具有明显的预防和保护作用。

综上所述，高、中浓度的灯笼草，可以明显缓解小鼠过敏引起的消化道炎症，预防组缓解消化道过敏性炎变的表现与治疗组的作用相似。灯笼草对食物过敏具有明显地调节和缓解作用，但不能完全预防小鼠的消化道过敏反应。灯笼草可能是用于防治儿童食物过敏的有效药物，具有较高的临床研究价值。

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