神农香菊全草特征指纹图谱研究

詹晓莲，卢金清

(1.华中科技大学同济医学院附属协和医院药剂科，武汉 430022;2.湖北中医药大学药学院，武汉 430061)

神农香菊全草为菊科植物神农香菊［Dendranthema indicum(L.)Des Mon1.var.aromaticum Q.H．Liu et S.F.Zhang］的全草［1］。神农香菊药用部位为其干燥头状花序，该药具有疏风清热、平肝明目、散风降压的功效［2］，主要化学成分为黄酮类化合物［3］。笔者未见神农香菊全草化学成分特征图谱研究的文献。近年来，随着神农香菊的不断开发，需求量急剧增加，导致采挖神农香菊现象严重，野生资源遭到严重破坏。神农香菊人工种植又面临生长条件要求高，不能在平原地区大面积种植等困难。为了扩大神农香菊的药用部位，提高其药用价值，笔者对神农香菊全草部位的指纹图谱等进行了较系统的研究，采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法建立了神农香菊全草的特征图谱。经过系统适用性实验和方法学考察，发现神农香菊全草的特征图谱具有系统性、全面性和特征性，可以有效地鉴别神农香菊全草及其原药材，为全面评价和控制神农香菊的质量提供了科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Dionex-Ultimate 3000液相色谱仪，Starsorius BSI型电子分析天平(d=0.01 mg，北京赛多利斯天平有限公司)，UP520H超声波清洗机(熊猫集团南京电子计量有限公司)，Dionex-Acclaim.120 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱。

1.2 试药 甲醇为色谱纯(美国天地公司，批号:100019-200703)，磷酸(上海振兴化工一厂，分析醇，批号:112041-200611)，磷酸二氢钾(上海实验试剂有限公司，批号:100745-200701)，水为双蒸水，木犀草素对照品(中国药品生物制品检定所，批号:111520-200201)，神农香菊［由湖北中医药大学中药鉴定教研室陈科力教授鉴定为Dendranthema indicum(L.)Des Mon1.var.aromaticum Q.H.Liu et S.F.Zhang，共 10 个样品，见表1］。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Dionex-Acclaim.120 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以磷酸盐缓冲溶液(pH=2.5)为流动相A，以甲醇为流动相B，按表2进行梯度洗脱;流速:0.5 mL·min-1;检测波长 350 nm;柱温:35℃，理论塔板数按木犀草素峰计算应不低于3 000。

表1 不同来源的神农香菊全草样品

表2 流动相梯度洗脱表

2.2 试液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取木犀草素对照品适量，加甲醇制成每毫升含1.0 mg的溶液，即得对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 本品粉末过筛孔内径840 μm 筛(二号筛)，取1.0 g，精密称定，精密加入甲醇20 mL，称定质量，超声提取30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，过滤，滤液置蒸发皿中蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察及相似度计算

2.3.1 精密度实验 精密吸取1号供试品溶液5 μL，按上述色谱条件，连续进样5次，以木犀草素峰(峰7)作为参照峰，指定其α值为1.000，考察仪器精密度，各特征指纹峰相对保留时间和特征指纹峰相对峰面积的RSD值分别在0.3%～1.0%和1.1%～2.8%之间，均＜3%，符合指纹图谱的要求。

2.3.2 稳定性实验 取3号供试品溶液，按上述色谱条件，分别于0，3，6，9，12，24 h 进行检测，以木犀草素峰为参照，指定其α值为1.000，考察供试品溶液的稳定性，各特征指纹峰相对保留时间和特征指纹峰相对峰面积的RSD值分别在0.2%～0.9%和1.1%～2.8%之间，均＜3%，符合指纹图谱的要求。

2.3.3 重复性研究 取本品5号粉末［过筛孔内径为(850±29)μm 筛］5份，每份1.0 g，精密称定，照“供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，以木犀草素峰为参照，指定其α值为1.000，考察方法的重复性，各特征指纹峰相对保留时间和特征指纹峰相对峰面积的RSD值分别在0.2% ～0.9%和1.3% ～2.9%之间，均＜3%，符合指纹图谱的要求。

2.4 指纹图谱及技术参数 取样品粉末［过筛孔内径(850±29)μm］10批，每份1.0 g，照“供试品溶液的制备”项下的方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定。选定木犀草素峰作为参照，指定的α值为1.000，特征指纹峰相对保留时间和特征指纹峰相对峰面积的结果见表3，4。

表3 神农香菊全草共有特征指纹峰相对保留时间

表4 神农香菊全草共有特征指纹相对峰峰面积

通过对10批神农香菊药材全草指纹图谱的HPLC-FPS和不同样品间HPLC-FPS的比较，建立神农香菊药材对照指纹图谱，各样品指纹图谱特征峰与对照指纹图谱特征峰有良好的重复性，神农香菊全草指纹图谱应有10个特征峰。见图1。

图1 神农香菊全草对照药材指纹图谱7.木犀草素

2.5 相似度计算 根据国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版，笔者计算了神农香菊10批药材全草的相似度，结果分别为0.972，0.987，0.965，0.972，0.957，0.966，0.979，0.986，0.952，0.990。

3 讨论

3.1 色谱柱的选择 经实验研究，选择用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，曾使用过 Diamasil(200 mm ×4.6 mm，5 μm)、Agilent ZOBAX SB-C18(250 mm×3.0mm，5 μm)、TURNER KromasilTM(4.6 mm×250 mm，5 μm)及 Dionex-Acclaim.120 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，最后根据色谱峰的分离效果及稳定性等因素综合考虑，选择使用 Dionex-Acclaim.120 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱。

3.2 流动相的选择 笔者曾使用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.4%磷酸作为流动相进行等度及梯度洗脱，结果木犀草素的色谱峰对称性差且各色谱峰分离度不好，最后根据分离情况和色谱峰的对称性选择以磷酸盐缓冲溶液(pH=2.5)为流动相A，以甲醇为流动相B，进行梯度洗脱效果最佳。

3.3 10批药材全草指纹图谱相似度评价 10批不同产地神农香菊全草样品的指纹图谱面貌基本一致，由各产地神农香菊全草指纹图谱相似度良好(r＞0.90)，反映了药材的同源性，可以用来作定性鉴别。

本方法稳定、可靠、重复性好，可为神农香菊全草及其制剂质量标准的拟定提供参考依据，为神农香菊物质基础研究与应用提供科学依据。可以有效地鉴别神农香菊，并评价其质量，完善了神农香菊的质量评价体系，有利于其进一步的开发利用。

［1］ 刘启宏，张树藩.神农架菊属一新变种［J］.武汉植物研究，1983，1(2):237.

［2］ 李志浩，李鹏，朱雪松，等.反相高效液相色谱法同时测定神农香菊中绿原酸木犀草素和蒙花苷的含量［J］.医药导报，2010，29(4):527-529.

［3］ 袭复俊，王国亮，袁晓，等.神农香菊花的化学成分研究(Ⅱ)［J］.武汉植物研究，2005，23(6):610-612.