因宁片对甲亢大鼠肝细胞凋亡调节蛋白Caspase-3和Bcl-2表达的影响

周 静，王成蹊，潘弟仪，周 涛，侯连兵

(南方医科大学南方医院药学部，广东 广州 510515)

甲状腺功能亢进症(hyperthyroidism)简称甲亢，可影响全身多系统、多器官功能，近年来甲亢合并肝脏损害在临床上多有报道。目前关于甲亢合并肝损害的发病机制尚不清楚，研究发现细胞基因异常调控及凋亡机制参与了其病理损伤过程，故推测细胞凋亡是造成肝损害的重要因素[1]。因宁片是南方医院治疗甲亢的医院制剂，能有效控制甲亢的症状和体征[2]，并对肝脏有保护作用。本研究旨在观察因宁片对甲亢大鼠肝细胞凋亡相关蛋白半胱天冬酶-3(Caspase-3)和B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)的影响，探讨其药理作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

SD大鼠，SPF级，体重180～220 g，雌雄各半，购自南方医科大学动物实验中心，动物许可证号为SCXK粤2006-0015。甲状腺片(40 mg/片，上海实业联合集团长城药业有限公司，批号为20090501);因宁片(由黄芪、当归、生地、鳖甲、麦冬等9味药材组方，广州南方医院院内制剂，批号为20051230);甲亢灵片(湖南飞鸽药业有限公司，批号为0901052)。SDS电泳系统(北京君意东方电泳设备有限公司);半干转膜仪(美国Bio-rad公司);Kodak Image Station 2000MM成像系统(美国 Kodak公司);磁力搅拌器(PH baiskT/C);多标记微孔检测仪(VICTOR3)。

1.2 方法

1.2.1 分组与试验方法

取60只SD大鼠，按体重、性别相近原则随机分为6组，每组10只，即空白对照组(A组)，模型组(B组)，因宁片低剂量组(C1组)、中剂量组(C2组)、高剂量组(C3组)，甲亢灵阳性对照药组(D组)。喂养适应1周后，除A组以等量生理盐水灌胃外，其余5组灌胃给予甲状腺片1.2 g/(kg·d)。造模30 d后，除A组继续给予等量生理盐水灌胃、B组继续灌胃甲状腺片外，其余4组在给予甲状腺片的同时分别灌胃给予因宁片0.6，1.2，2.4 g/(kg·d)和阳性药甲亢灵1.2 g/(kg·d)，各组均再连续给药30 d。末次给药后24 h，以10%水合氯醛350 mg/kg麻醉，腹腔静脉采血，4 000 r/min离心10 min，取血清，用放射免疫法测血清三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、促甲状腺激素(TSH)，用全自动生化仪检测血清天门冬酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)，按试剂盒说明书操作。取肝脏，液氮速冻后，放置-80℃冰箱待测。

1.2.2 Western-Blot法检测Caspase-3和Bcl-2蛋白水平

组织蛋白样品提取:称取大鼠的肝脏组织100 mg，剪碎，每50 mg组织加入300 μL Western和IP细胞裂解液(之前加入蛋白酶抑制剂和苯甲基磺酰氟)，于冰上静置60 min，低温高速离心2次(每次以12 000 r/min离心10 min)，取上清液，即为提取的肝脏组织总蛋白。

蛋白质定量(BCA蛋白定量法):以Solutian A加Solutian B(50∶1)配制BCA工作液，充分混匀。以1∶30稀释蛋白样品，按说明书加标准品及样品至96孔板中，每孔稀释至20 μL，加入200 μL BCA工作液，混匀，37℃放置30 min。测定562 nm波长处的吸收度，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)与Western印迹:1)样品处理。吸取150 μg肝脏组织总蛋白，加入5倍体积电泳上样缓冲液(Tris-Cl 250 mmol/L，pH=6.8，10%十二烷基磺酸钠，500 mmol/L二硫苏糖醇，50%甘油，0.5%溴酚蓝)，98℃加热 5 min，变性。2)跑胶。灌制12%SDS-PAGE分离胶，5%SDSPAGE积层胶，上样150 μg肝脏组织总蛋白(体积大约25 μL)。3)电泳。恒压80 V、维持40 min，当溴酚蓝前沿进入分离胶时，将电压提高到120 V、维持90 min直到溴酚蓝到达分离胶底部，根据Mark条带的相对分子质量切下目的蛋白和内参。4)半干转膜。恒流120 mA，维持70 min，将蛋白从SDS-PAGE凝胶转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用5%的脱脂奶粉封闭1.5 h，TBS-T洗脱液洗脱，每次5 min，洗3次。5)加一抗:兔多克隆抗体Caspase-3以1∶300稀释，兔多克隆抗体Bcl-2以1∶500稀释，兔多克隆抗体βactin以1∶1 000稀释，4℃孵育过夜。TBS-T洗脱液洗脱，每次5 min，洗3次。6)加二抗:鼠抗、兔二抗以1∶2 000稀释，室温孵育2 h，用 BeyoECl Plus发光液显影。7)分析:以 Kodak Image Station 2000 MM成像系统采集图像，将获得图像用Image Tool 3.0图像处理软件分析，用Caspase-3/β-actin代表Caspase-3的相对表达量，以Bcl-2/β-actin代表Bcl-2的相对表达量。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠血清甲状腺功能与肝功能变化

结果见表1。与A组比较，B组血清T3和T4水平升高，而TSH反馈性降低，肝功能出现明显异常;治疗后，C1，C2，C3组和D组T3和T4水平均降低，TSH水平升高，肝功能明显改善，与B组比较有显著性差异(P＜0.05)，且因宁片各组呈现剂量依赖性，高剂量组作用最明显。

表1 各组血清甲状腺功能和肝功能指标比较(n=10，±s)

表1 各组血清甲状腺功能和肝功能指标比较(n=10，±s)

注:与 B 组比较，△P ＜0.05，▲P ＜0.01(下表同)。

组别 甲状腺功能 肝功能A组B组C1组C2组C3组D组T3(nmol/L)2.15±0.82▲6.74±1.73 5.82±1.66△4.61±0.83△4.27±0.62△4.87±1.05△T4(nmol/L)35.21±9.91▲183.61±22.79 125.36±15.87△98.61±10.05△85.32±17.25△106.59±19.29△TSH(mU/L)3.47±0.13▲1.76±0.07 2.63±0.50△2.78±0.74△2.89±0.81△2.82±0.63△ALT(U/L)49.27±8.63▲108.25±21.31 86.44±10.72△75.22±12.87△69.39±10.15△88.13±11.08△AST(U/L)134.94±18.55▲289.36±36.73 217.33±24.19△191.83±15.94△182.45±16.80△205.09±19.92△

2.2 对甲亢大鼠肝组织Caspase－3和Bcl－2蛋白表达的影响

结果见表2、图1和图2。可见，对Caspase-3和 Bcl-2蛋白表达的影响大小排序为C3组、D组、C2组。

表2 各组大鼠肝组织Caspase-3和Bcl-2蛋白表达水平比较(±s)

表2 各组大鼠肝组织Caspase-3和Bcl-2蛋白表达水平比较(±s)

组别A组(n=10)B组(n=10)C1组(n=10)C2组(n=10)C3组(n=10)D组(n=10)Caspase-3蛋白0.952 2±0.022 8▲1.270 7±0.022 7 1.220 8±0.022 4 1.138 3±0.026 3△0.920 6±0.016 0▲0.962 7±0.032 1▲Bcl-2蛋白1.020 6±0.014 2▲0.576 7±0.034 4 0.697 7±0.448 4 0.885 7±0.012 2△0.936 2±0.008 3▲0.884 2±0.011 1△

图1 Western Blot测定各组Caspase-3和Bcl-2蛋白表达情况

图2 各组Caspase-3和Bcl-2蛋白表达水平比较注:与 B组比较，△P＜0.05，▲P＜0.01。

3 讨论

甲状腺激素可影响机体所有组织器官的代谢过程。从1874年Habershon[3]首次描述甲亢患者合并肝损害后，相关的病例在临床上被广泛报道，但有关动物实验研究不多，鲜有中药复方治疗甲亢合并肝损害的实验报道。甲状腺和肝脏的相互作用包括甲亢全身作用继发的肝损害和甲状腺激素对肝脏的直接作用。多数情况下，肝脏损害表现为非特异性脂肪变，包括脂肪浸润、胞质空泡化、核不规则、线粒体数量减少、嵴消失等改变。越来越多的证据表明，细胞凋亡在非酒精性脂肪变(包括肝缺血-再灌注损伤、肝炎、肝肿瘤等)中起重要作用[4]。国外也有报道，甲亢鼠肝脏存在细胞凋亡过程异常亢进[5]。

天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)在细胞凋亡的过程中起关键作用，细胞凋亡各个阶段都可以检测到不同程度的Caspase增高。Caspase在组织中含量的改变决定了细胞凋亡的进展方向[6]。凋亡是蛋白酶级联切割的过程，其中Caspase-3处于核心位置，不同的蛋白酶切割Caspase-3酶原，活化的Caspase-3又进一步切割不同的底物，导致蛋白酶切割级联放大，从而激活核酸酶破坏细胞结构，DNA裂解使染色质浓缩、细胞皱缩，形成凋亡小体，最终使细胞走向死亡[6]。Caspase-3是执行性Caspase，因此被称为死亡蛋白酶。本研究显示，甲亢模型组Caspase-3蛋白表达明显增加，表明肝细胞凋亡亢进;各治疗组Caspase-3蛋白表达与模型组比较明显下降，以因宁片高剂量组最明显，表明因宁片能抑制肝细胞凋亡的核心因子Caspase-3的表达，这可能是因宁片抑制细胞凋亡、保护肝组织的重要作用机制之一。

B细胞淋巴瘤/白血病-2家族位于线粒体外膜上，包括抗凋亡蛋白(Bcl-2，Bcl-XL等)和促凋亡蛋白(Bax，Bad 等)。其中Bcl-2是一种重要的凋亡抑制蛋白，具有保护细胞的功能，Bcl-2的过度表达可引起细胞核谷胱甘肽的积聚，导致核内氧化还原平衡的改变，从而降低了Caspase的活性，阻止凋亡诱导因子和细胞色素C从线粒体的释放，抑制凋亡[7]。本研究结果显示，甲亢鼠Bcl-2蛋白表达下降，说明甲亢时抗凋亡蛋白表达抑制;经药物治疗后，各组Bcl-2蛋白表达明显上调，肝细胞凋亡减少，说明因宁片对肝细胞凋亡及凋亡相关蛋白的表达有一定的作用。

本研究中观察到，在给大剂量甲状腺激素造成转氨酶(AST和ALT)升高的同时，肝组织Caspase-3蛋白表达明显上调、Bcl-2蛋白表达明显下降，说明凋亡是Caspase依赖性的，过多的甲状腺激素使大鼠肝组织细胞凋亡平衡被打破，凋亡通路中的执行蛋白酶被激活，抗凋亡蛋白表达受抑制，细胞凋亡亢进，从而造成肝细胞损害。高、中、低剂量的因宁片和阳性药甲亢灵能降低血中甲状腺激素T3及T4水平，降低转氨酶含量，逆转凋亡异常亢进。高、中剂量的因宁片明显降低Caspase-3蛋白的表达，提高凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达。可见，因宁片的作用呈现出良好的剂量依赖性量效关系。

因宁片以消瘿软坚、解毒散结原理组方，治疗甲亢的临床效果显著，能降低血中甲状腺激素的水平，改善甲亢症状和体征。本研究证明，因宁片能显著抑制甲亢时肝细胞凋亡，从而减轻肝损伤、保护肝脏。为明确因宁片的药理作用机制，对肝细胞凋亡的其他信号转导的作用尚有待进一步研究。

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