穴位电刺激对大鼠急性运动后腓肠肌收缩功能的影响

刘堂义,杨华元,蒯乐,高明,杨旭明



穴位电刺激对大鼠急性运动后腓肠肌收缩功能的影响

刘堂义,杨华元,蒯乐,高明,杨旭明

(上海中医药大学针灸推拿学院中医工程研究室,上海 201203)

探讨穴位电刺激疗法对大鼠急性运动后腓肠肌收缩功能的影响。45只SD大鼠,随机分成三组,适应性游泳训练1星期后,进行急性运动(2 h的游泳),全麻下取腓肠肌,应用差速离心法提取SR,检测肌质网(SR)钙泵(Ca2＋-ATPase)、Ca2＋浓度;30只SD大鼠,随机分成正常对照组、急性运动模型组、穴位电刺激治疗组三组,运动后制备坐骨神经-腓肠肌标本,在SMUP-E型生物信息处理系统上观察腓肠肌最大收缩力。模型组大鼠腓肠肌SR Ca2＋-ATPase的活力明显低于对照组(＜0.05),治疗组则明显高于模型组(＜0.05);模型组大鼠腓肠肌SR Ca2＋浓度明显高于对照组(＜0.05),治疗组则明显低于模型组(＜0.01),治疗组与对照组差异无统计学意义(＞0.05);模型组大鼠腓肠肌的最大收缩力明显小于对照组(＜0.05),而治疗组则明显大于模型组(＜0.05)。一次性急性游泳(2 h)大鼠腓肠肌SR的Ca2＋-ATPase活性明显下降,Ca2＋浓度显著升高,腓肠肌的最大收缩力下降;穴位电刺激则可以明显提高大鼠腓肠肌SR Ca2＋-ATPase的活力,降低SR内Ca2＋浓度,增强大鼠腓肠肌的最大收缩力。这可能是穴位电刺激疗法延缓运动疲劳的机理之一。

电针疗法;肌质网;Ca2＋转运ATP酶;钙离子;最大收缩力;穴,足三里;穴,承山

既往的试验观察发现,穴位电刺激方法可以有效地提高运动员快速力量[1-3]。骨骼肌SR的Ca2＋-ATPase (钙泵)在骨骼肌运动过程中起着重要的作用,是骨骼肌兴奋收缩耦联的关键步骤,它直接影响到运动员竞技过程中的快速力量及运动性疲劳的产生,而骨骼肌收缩功能则直接反映骨骼肌的快速力量及疲劳的程度。本项目通过观察穴位电刺激方法对急性运动后大鼠骨骼肌收缩能力及肌质网Ca2＋-ATPase功能、Ca2＋浓度的影响,探讨穴位电刺激延缓运动性疲劳的作用机理,为进一步完善穴位电刺激方法及研制专门的穴位电刺激仪器提供实验依据,既是前期研究工作的延续,也为深入的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

1.1.1 大鼠腓肠肌SR Ca2＋-ATPase的检测

50只SD雄性大鼠,由上海中医药大学动物实验中心提供[实验动物使用许可证号为SYXK(沪)2004- 0005],常规饲养,动物实验过程完全遵照国家科技部“实验动物护理和使用指南”[4]。分组前进行适应性训练1星期,第1天20 min,以后每天增加10 min,第6、7天均为1 h,剔除不适合游泳者,选取45只大鼠。常规饲养。第8天将45只大鼠随机分成三组(对照组、模型组、治疗组),每组15只大鼠,对照组不固定、不游泳,模型组在鼠架上固定20 min,休息10 min,置水槽中游泳[水槽高1.4 m,水深1 m,水温(30±2)℃],时间为2 h,游泳期间密切观察大鼠游泳状况,如发现沉底超过5 s者,即捞出让其休息3 min,再游泳,直至2 h。治疗组大鼠固定于鼠架上,进行穴位电刺激,时间为20 min,治疗结束后休息10 min,再进行游泳,游泳方法同模型组。游泳结束后进行实验。

三组大鼠均于腹腔注射20g/L戊巴比妥钠(1.2 mL /kg)麻醉,取左下肢腓肠肌(完整肌群,具体方法见下文),洗净备检。

1.1.2 大鼠腓肠肌最大收缩力的检测

35只SD大鼠经过游泳训练选取30只大鼠,分组及游泳处理方法同第一次实验。游泳结束后,大鼠进行肌力测试(操作方法见本文1.3.4)。

1.2 选穴

双侧足三里、承山。选穴方法参见五版统编教材《实验针灸学》。

1.3 实验方法

SMUP-E型生物信息处理系统由复旦大学医学院生理与病理生理学系生产;G6805-2型电针仪由上海市医疗器械高技术公司生产;Ca2＋试剂盒由南京建成生物有限公司生产;Ca2＋-ATPase试剂盒由南京建成生物有限公司生产。

1.3.1 肌质网(SR)囊泡的制备

参照Carl法[5],将骨骼肌标本用预冷的标准Hank's液冲洗3次,置预冷的5倍体积(重量比容量) SR提取缓冲液中。SR缓冲液为蔗糖0.25 mol/L,Tris- HCl 10 mmol/L,pH 7,EDTA-Na20.1 mmol/L。骨骼肌先剪碎,高速匀浆30 s,2次,期间间膈30 s,组织匀浆经四层纱布过滤,离心1000×,20 min,保留上清液,沉淀物再加5倍体积SR提取缓冲液,重复前述匀浆离心过程,收集混合两次上清液,弃沉淀物。再离心40000×,90 min,弃上清,沉淀用0.6 mol/L KCl混悬冰上静置15 min,再离心40000×,90 min,最后沉淀的SR用不含EDTA的上述SR提取缓冲液混悬。考马斯亮兰法进行蛋白定量,调蛋白浓度至2 g/L,液氮速冻后置－70℃冰箱保存备用。

1.3.2 骨骼肌肌质网Ca2＋-ATPase活力的测定

参照南京建成Ca2＋-ATPase试剂盒所附的方法测定Ca2＋-ATPase活力,其计算方法为每小时每毫克蛋白分解ATP产生1mmol无机磷的量为一个ATP酶活力单位,即mmolPi/mgprot/hour。

1.3.3 骨骼肌肌质网Ca2＋浓度测定

参照南京建成Ca2＋试剂盒所附的方法测定Ca2＋-ATPase活力。应用比色法测定肌质网Ca2＋浓度,单位为mmol/gprot。

1.3.4 坐骨神经-腓肠肌标本的制备

实验动物麻醉后,俯卧位固定于手术板上,剃去大鼠后肢及躯干后背部的毛,沿着后肢内侧自踝部向上至大腿根部上方3 cm处剪开皮肤,小心剥离,暴露肌层,沿踝部正中线长轴向上纵行切开股二头肌,待其向两侧分离,确认中间有下腓肠肌后,分离腓肠肌至跟腱处,通过张力换能器与SM-MUL生理记录仪相连,然后剪断跟腱端,膝关节端固定于定位仪上。另由左侧梨状沟处分离出坐骨神经,将SM-MUL生理记录仪的刺激电极与之相连。至此制成小鼠在体的坐骨神经-腓肠肌标本。

1.3.5 大鼠腓肠肌收缩能力测试

用方波单刺激坐骨神经,方波电压4 V,间隔时间0.4 ms,刺激20次,取最大值。

2 实验结果

2.1 大鼠腓肠肌SR Ca2＋-ATPase及肌质网Ca2＋浓度的检测结果

表1显示,模型组大鼠腓肠肌SR Ca2＋-ATPase的活力明显低于对照组(＜0.05),治疗组则明显高于模型组(＜0.05);而模型组肌质网内Ca2＋浓度明显高于对照组(＜0.05),治疗组则明显低于模型组(＜0.01);治疗组大鼠腓肠肌SR Ca2＋-ATPase的活力、肌质网Ca2＋浓度与对照组比无显著性差异(＞0.05)。结果提示,一次性急性游泳(2 h)可以使大鼠腓肠肌SR Ca2＋-ATPase明显下降,肌质网Ca2＋浓度则明显升高,而穴位电刺激则可以明显提高大鼠腓肠肌SR Ca2＋-ATPase的活力,降低肌质网Ca2＋浓度,基本恢复到运动前水平。

表1 三组实验大鼠腓肠肌SR Ca2＋-ATPase及肌质网Ca2＋浓度检测结果 (±s)

注:与模型组比较1)＜0.05,2)＜0.01

2.2 大鼠腓肠肌最大收缩力的检测结果

表2显示,模型组大鼠腓肠肌的最大收缩力明显小于对照组(＜0.05),而治疗组则明显大于模型组(＜0.05)。实验结果提示,一次性急性游泳(2 h)可以明显减小大鼠腓肠肌的最大收缩力,而通过穴位电刺激则可以明显提高大鼠腓肠肌的最大收缩力。

表2 三组实验大鼠腓肠肌最大收缩力的检测结果(±s)

注:与模型组比较1)＜0.05

3 讨论

国内90年代开始有科研人员探讨针刺对胞质Ca2＋及肌质网转Ca2＋功能的影响。如动物实验发现超负荷运动可导致肌细胞超微结构改变,细胞内Ca2＋活度升高,骨骼肌膜电位的绝对值均显著降低,而针刺治疗能够改善细胞内Ca2＋的代谢,从而促进超微结构损伤的修复[6]。针刺还可以使超负荷运动所致增高的骨骼肌细胞内Ca2＋活度值迅速降低,肌细胞膜电位得到迅速恢复[7]。有人利用电刺激诱发爪蟾腓肠肌结构损伤模型及电子探针微区分析技术测定细胞内Ca2＋、Na＋、Mg2＋、Cl－浓度,结果发现针刺在体或离体的损伤肌肉均能使肌纤维胞质内增加的Ca2＋浓度迅速降至对照组水平。与此同时,肌质网Ca2＋含量无明显改变,而胞质Na＋则进一步上升,不仅高于对照组,也高于在体未针刺肌,利用荧光指示剂Fura-2测定离体青蛙半腱肌胞质自由Ca2＋浓度,发现针刺使正常肌Ca2＋上升,而使长时间电刺激至力竭疲劳肌肉细胞内Ca2＋下降[8]。

本次实验结果发现,一次性急性运动导致了大鼠骨骼肌肌质网内Ca2＋水平显著升高,而SR Ca2＋-ATPase (钙泵)的活力明显下降,腓肠肌收缩能力下降。造成这种结果的原因可能是由于运动过程中为适应骨骼肌收缩的需要,钙泵不断摄取Ca2＋,但随着运动时间的延长,可能受多种途径原因的影响,钙泵释放Ca2＋的能力下降,导致Ca2＋在肌质网堆积,反过来影响钙泵的活性,最终影响钙泵摄取和释放Ca2＋的能力,抑制了骨骼肌兴奋-收缩耦联,引起骨骼肌收缩功能下降。根据近年来有关于肌质网内钙泵功能与骨骼肌收缩能力关系的研究结果,我们分析造成这种结果的原因可能有以下几点。第一,骨肌质内Ca2＋的水平与钙泵的活性有关。钙泵的活性受多种生化因素的调节,而且多数是因为钙泵摄取和释放Ca2＋、水解ATP的循环途径中某个状态受到影响所导致。如SR膜上的磷脂酞乙醇的含量变化可直接影响钙泵活性和Ca2＋摄取能力[9,10],膜流动性的改变通过影响SR钙泵的构象而改变其活性[11,12],当摄入到SR内侧的Ca2＋达到一定浓度时与磷脂酞胆碱发生作用,通过影响膜的流动性、调节钙泵的构象而抑制钙泵的活性[13],因此摄取到SR内侧的Ca2＋对钙泵活性起反向抑制作用,这也说明肌质网内Ca2＋水平可能反过来影响钙泵的功能。第二,多种原因影响Ca2＋释放通道(RyR1受体)的活性。急性运动导致的肌肉疲劳、缺氧等病理状态可能起着调控RyR1受体功能作用,这些原因导致了RyR1受体活性下降,影响肌质网内Ca2＋的释放,导致Ca2＋的堆积[14]。第三,急性运动导致SR数目减少(包括囊泡腔内Ca2＋结合区域和空间减少)及Ca2＋-ATPase降解和合成的速率增加有关,有研究表明蛋白周转的速率可能影响肌肉收缩活动的适应能力和重塑能力[15]。第四,穴位电刺激方法影响钙泵的活性可能与细胞内能量代谢、自由基代谢等改变有关。有研究表明,穴位电刺激方法可以显著性提高疲劳大鼠骨骼肌ATPase、LDH和CPK活性[16],纠正自由基代谢,减少代谢产物的堆积[17]。第五,骨骼肌肌力的增强还有可能与神经因素有关。运动性疲劳的产生可能与运动神经的兴奋性改变(如神经冲动发放的频率减少或衰减)、神经肌肉接点处的棘突动作电位的改变、兴奋和抑制兴氨基酸的分泌等因素有关[18],有研究表明经皮电刺激方法可以有效促进周围神经再生,改善受损的神经支配的肢体功能[19]。

为适应现代竞技体育的需求,针灸与体育科研人员进行了密切的合作,将传统的针灸疗法与电刺激方法相结合,形成了穴位电刺激方法,进行了提高运动员快速力量及延缓运动性疲劳方面的研究,取得了一定的科研成果[10]。本次实验主要探讨了穴位电刺激方法对急性运动大鼠骨骼肌肌质网Ca2＋浓度及Ca2＋-ATPase活力的影响,提示穴位电刺激可能通过影响肌质网Ca2＋循环,达到延缓急性运动性疲劳的目的。进一步的研究可以继续探讨穴位电刺激方法对钙泵形态、结构、功能等的影响,以及对Ca2＋转运功能的影响,有助于揭示穴位电刺激方法延缓运动性疲劳的机制。

[1] 吴瑛,郑毓春,徐光辉,等.提高运动员快速力量的穴位刺激效应时间的研究[J].上海体育学院学报,1998,22(4):34-37.

[2] 杨华元,刘堂义,蒯乐,等.穴位电刺激增强运动员快速力量的作用观察[J].中国针灸,2006,26(5):313-315.

[3] 杨华元,谢佳吟.应用中医药方法增强肌力的实验研究进展[J].中国临床康复,2002,6(1):110.

[4] The Ministry of Science and Technology of the People’s Republic of China. Guidance Suggestions for the Care and Use of Laboratory Animals, 2006,(9):30.

[5] Carl SL, Felix K, Caswell AH. Immunolocalizaion of triadin, DHP receptors,and ryanodine receptors in adult and developing skeletal muscle of rats[J]. Muscle verve, 1995,18:1232-1243.

[6] 易学,马国义.针刺对家兔超负荷运动骨骼肌细胞内钙离子活度的影响[J].中国临床康复,2005,9(28):211-213.

[7] 李澎涛,易学.针刺对家兔超负荷运动骨骼肌细胞内钙离子活度的影响[J].中国针灸,1994,14(6):30-32.

[8] 屈竹青,张均田.针刺正常骨骼肌及力竭肌对胞浆自由钙离子浓度的影响机制[J].北京体育大学学报,1994,17(2):36-41.

[9] Hasselbach W, Seraydarian K. The role of sulphydry groups in calcium transport through the sarcoplasmic membranes of skeletal muscle[J]. Biochem Z, 1996,345:159-172.

[10] Launikonis BS, Ríos E. Store-operated Ca2＋entry during intracellular Ca2＋release in mammalian skeletal muscle[J]. J Physiol, 2007,583 (Pt1):81-97.

[11] Dutka TL, Cole L, Lamb GD. Calcium phosphate precipitation in the sarcoplasmic reticulum reduces action potential-mediated Ca2＋release in mammalian skeletal muscle[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2005,289(6):C1502-1512.

[12] 杨勇骥,邢萱,汤莹,等.肌兴奋收缩偶联时肌浆网的超微结构研究[J].电子显微学报,2006,25(增刊):217-218.

[13] 韩红梅,尹长城.Ca2＋对骨骼肌钙释放通道的调节[J].生理科学进展,2006,37(2):132-135.

[14] 周贞洁,刘仁臣,蔡知音,等.钠、钾离子对肌质网囊泡NADH氧化酶和伴生超氧自由基的调控[J].航天医学与医学工程,2006,19(3): 183-188.

[15] Shkryl VM, Shirokova N. Transfer and tunneling of Ca2＋from sarcoplasmic reticulum to mitochondria in skeletal muscle[J]. J Biol Chem, 2006,281(3):1547-1554.

[16]杨华元,谢佳吟,顾训杰,等.穴位电刺激对大鼠骨胳肌能量代谢的影响[J].中国针灸,2001,21(4):239-240.

[17] 吴立红,方剑乔,邵晓梅,等.经皮穴位电刺激足三里对抗大鼠运动性疲劳[J].中国临床康复,2005,9(40):114-117.

[18] 曲绵域,于长隆.实用运动医学[M].北京:北京大学医学出版社, 2003:37-38.

[19] 李琦,曾炳芳,王金武,等.经皮神经肌电刺激治疗周围神经损伤的疗效观察[J].中国康复医学杂志,2007,22(7):628-630.

Effect of Acupoint Electrostimulation on Gastrocnemius Contractility in Rats after Acute Exercise

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,-,201203,

To explore the effect of acupoint electrostimulation on gastrocnemius contractility in rats after acute exercise.Forty-five SD rats were randomly allocated to three groups. Acute exercise (2 hr swimming) was done after adaptive swimming training. The gastrocnemius was taken under general anesthesia. The sarcoplasmic reticulum (SR) was extracted by differential centrifugation. SR calcium pump (Ca2＋-ATPase) and Ca2＋concentration were measured. The 30 SD rats were randomly allocated to three groups: normal control, model of acute exercise and acupoint electrostimulation treatment. A specimen of sciatic nerve–gastrocnemius was made after the exercise. The maximum gastrocnemius contractility was determined using a SMUP-E bioinformation process system.Gastrocnemius SR Ca2＋-ATPase activity was significantly lower in the model group of rats than in the control group (＜0.05) and was significantly higher in the treatment group than in the model group (＜0.05). Gastrocnemius SR Ca2＋concentration was significantly higher in the model group of rats than in the control group (＜0.05) and was significantly lower in the treatment group than in the model (＜0.01). There were no statistically significant differences between the treatment and control groups (＞0.05). The maximum gastrocnemius contractility was significantly lower in the model group of rats than in the control (＜0.05) and was significantly higher in the treatment group than in the model group (＜0.05).Gastrocnemius SR Ca2＋-ATPase activity decreases significantly, Ca2＋concentration increases significantly and the maximum gastrocnemius contractility decreases in rats after an acute swim (2 hrs). Acupoint electrostimulation can significantly increase gastrocnemius SR Ca2＋-ATPase activity, decrease SR Ca2＋concentration and strengthen maximum gastrocnemius contractility in rats. This may be one of the mechanisms by which acupoint electrostimulation therapy delays sports fatigue.

Electroacupuncture; Sarcoplasmic reticulum; Ca2＋-ATPase; Calcium ion; Maximum contractility; Acupoint, ST 36; Acupoint, BL 57

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2011.10.707

1005-0957(2011)10-0707-04

上海高校优秀青年教师后备人选科研项目(04YQHB130)

刘堂义(1969 - ),男,副教授,博士

2010-12-27