佳美苦瓜纯度的SRAP鉴定

许端祥，高山，林碧英，傅睿清

（福建福州市蔬菜科学研究所，350111）

苦瓜（Momordica charantiaL.）为葫芦科苦瓜属一年生攀缘草本植物，起源于东南亚的热带地区，广泛分布于热带、亚热带及温带地区，在中国、印度、日本、东南亚都有悠久的栽培历史。佳美苦瓜是福州市蔬菜科学研究所继佳玉苦瓜[1]之后培育的苦瓜新品种，其母本是强雌系43-C，父本为自交系59-W。佳美苦瓜植株生长势强，分枝力强，早中熟，主蔓第一雌花着生8~12节，雌花率高；从开花到商品瓜成熟需15~20 d，商品瓜呈长棒形，尾部钝圆，瓜长26~35 cm，横径5~7 cm，肉厚1.1 cm；瓜皮色绿有光泽，瓜面圆瘤与短纵瘤相间，瓜形美观，成熟瓜不褪绿，肉质甘脆微苦，品质优良，单瓜质量400~500 g，667 m2产量3 000 kg左右。目前已在福建、广东、湖北、四川等地示范推广，表现反映良好，种植面积不断扩大。

随着种植面积的扩大，其用种量逐步增大，种子质量的控制就显得尤为重要。种子纯度是种子质量的主要指标，种子纯度的降低会明显降低作物的产量和产品品质。目前国内外对农作物品种的纯度鉴定仍以形态指标鉴定为主，其特点是准确可靠，但检测周期长，不能满足当年用种需要。为缩短鉴定周期，同工酶技术已应用于瓜类蔬菜杂种纯度的鉴定[2，3]，但同工酶多态性不够丰富，同时有组织和器官特异性，大大降低了鉴定结果的稳定性和准确性。随着分子生物学的快速发展，以PCR为基础的DNA 分子标记技术如RAPD，SCAR，SSR，ISSR等得以发展与应用。其中SRAP（sequence related amplified polymorphism）是一种新型的分子标记技术，其操作简便，无需预先知道基因组信息，且具有丰富的多态性[4]。

本研究以佳美苦瓜及其亲本为材料，采用SRAP分子标记技术，建立佳美苦瓜及其亲本的DNA指纹图谱，为其纯度鉴定和知识产权保护提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

苦瓜品种佳美及其亲本均由福州市蔬菜科学研究所苦瓜课题组提供。采用穴盘育苗，待幼苗长到2片真叶时取嫩叶待用。SRAP引物、Taq酶和dNTP等购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 试验方法

①DNA提取 以幼苗为材料，随机抽取苦瓜品种佳美及其父母本各20株，剪取刚展开的健康嫩叶，于液氮中研磨，采用改良的CTAB法[5]提取总DNA，用紫外分光光度计在260nm和280nm下测定OD值，检测DNA的质量和浓度，并将其稀释到30 ng/μL作为PCR扩增的模板。

②PCR扩增 扩增反应在PCR（Eppendorf Mastercyclergradient）仪上进行。SRAP反应参照Li等[4]的方法进行。对9个上游引物（Me1~9）和12个下游引物（Em1~12）组成的108对引物进行扩增筛选。25 μL的反应体系为：30 ng/μL DNA 模板，2.0 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTPs，0.25 μmol/L 引物，0.75 U Taq酶。扩增程序为：94℃预变性 5 min；94℃变性 1 min，35℃复性 1 min，72℃延伸 1 min，5 个循环；94℃变性1 min，50℃复性 1 min，72℃延伸 1 min，35 个循环；72℃ 10 min，4℃保存。

2 结果与分析

2.1 特征引物的筛选

按Li等[4]提出的原则设计引物，选用上海生工生物工程有限服务公司合成的SRAP的9个上游引物（Me1~9）和 12 个下游引物（Em1~12）组成的 108 个引物组合对材料进行扩增筛选。随机提取佳美的父本、母本及F1代植株各20株，建立混合池，其中有2对引物扩增的杂种谱带与父本有差异；有2对引物扩增的杂种谱带与母本有差异。

2.2 指纹图谱的建立

经多次试验，筛选出2对特征引物Me6（5'-BAAG-3'）-Em9（3'-DCAG-5'）（图 1）、Me8（5'-BACT-3'）-Em8（3'-DTGC-5'）（图 2），建立了佳美苦瓜的DNA指纹图谱。筛选的2对特征引物能同时扩增出F1代及其父母本的多态性条带，其扩增产物具有高度的稳定性和重复性。

图2 引物Me8-Em8佳美苦瓜和父母本基因组DNA的SRAP扩增

图1 引物Me6-Em9佳美苦瓜和父母本基因组DNA的SRAP扩增

2.3 杂种纯度的鉴定

将佳美杂交种种植于大田中，待幼苗长至2片真叶时，随机抽取100株单株并编号，按上述方法提取 DNA，选用 2 对特征引物 Me6（5'-BAAG-3'）-Em9（3'-DCAG-5'）、Me8（5'-BACT-3'）-Em8（3'-DTGC-5'）进行SRAP的分子鉴定。结果检测出3株单株无父本特异带只有母本特异带，说明这3株植株是母本苗，杂交种的纯度为97%。成株期鉴定植株的生物学性状，发现3株与母本性状一样，杂交率为97%，与SRAP鉴定结果一致。

3 小结

本试验通过优化DNA提取程序，严格控制DNA模板质量，优化反应体系。经多次试验，筛选出2对特征引物 Me6（5'-BAAG-3'）-Em9（3'-DCAG-5'）、Me8（5'-BACT-3'）-Em8（3'-DTGC-5'），建立了佳美苦瓜的DNA指纹图谱。在生产田中随机抽取单株并编号，苗期提取DNA进行SRAP分子鉴定，试验结果与大田植株成株期的形态鉴定结果高度吻合，说明利用SRAP分子技术建立DNA指纹图谱鉴定佳美品种的纯度是可行的。

[1]高山，林碧英，许端祥，等.苦瓜新品种佳玉的选育[J].中国蔬菜，2010（18）：89-90.

[2]孟祥波，张凤丽.同工酶技术在瓜类蔬菜上的应用研究[J].上海蔬菜，2010（1）：19-20.

[3]闫世江，张继宁，刘洁.同工酶技术在瓜类育种中的应用[J].蔬菜，2010（8）：33-35.

[4]Li G,Quiros C F.Sequence related amplified polymorphism(SRAP),a new marker system based on a simple PCR reaction:its application to mapping and gene tagging in Brassica[J].Theor Appl Genet,2001,103(2):455-461.

[5]王关林，方宏筠.植物基因工程[M].北京：科学出版社，2002：742-744.