眼科白内障超声乳化术中蓝域染色剂的化学助剂残留分析

沈亦红

(浙江省医疗器械研究所，浙江 杭州 310009)

近年来，白内障超声乳化手术开展极为普遍，然而在成熟期白内障和缺乏良好红光反射的白内障超声乳化手术过程中，完成连续环形撕囊极为困难，处理不当易造成撕囊口放射状撕裂及一系列严重并发症，影响超声乳化手术操作。为此，眼科临床不断地探索着各种方法，实践证明，前囊膜染色剂的应用可以很大程度上降低此类手术的难度，减少术中并发症的出现，提高手术成功率。目前蓝域染色在白色白内障超声乳化术中应用研究比较多，但未发现对于其本身化学物质溶出物的试验研究。从毒理学角度考虑，染色剂类医用材料中的易溶出物质，如化学助剂残留等是引起炎症和组织免疫反应的主要原因。因此，为了降低对眼内组织的毒性，保护白内障患者在超声乳化手术中的安全，对蓝域染色剂中化学助剂残留量的研究和控制非常重要。

目前，欧洲、日本、美国及中国均无染色剂中化学残留助剂的标准检验方法。由于蓝域染色剂组成复杂，分析时往往干扰测定，样品前处理既要保证残留助剂从样品基体中分离出来，又要防止其他干扰成分过度析出造成干扰。本次试验研究目的是预测溶出的水平，对从染色剂中可能溶出的残留助剂进行详细的分析，选择适当的样品前处理方法和仪器检测条件，使样品中被检测成分的分离效果更佳、灵敏度更高、受干扰的程度更小。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂。Agilent 6890N气相色谱仪、7694E顶空进样装置、氢火焰离子化检测器(FID)和色谱工作站 (Agilent公司，美国)，顶空瓶 (体积10mL);丙酮、异丙醇均为色谱纯，购自美国 TEDIA“天地”试剂公司;氯化钠(NaC1)为优级纯，购自德国默克公司，用前于450℃烘3～4h(去除吸附的有机物);Milli－Q超纯水。

1.2 标准溶液的配制。取10 mL容量瓶两个，加超纯水数毫升，准确称重。各滴加2滴丙酮和异丙醇，再称重。增加的量即为丙酮或异丙醇的量，加超纯水至刻度。计算含量后，取适量以上溶液用超纯水配置成2种化学助剂的混合标准溶液。此标准溶液浓度为:丙酮 9.05mg/mL，异丙醇10.62 mg/mL。准确移取一定体积的混合标准中间工作液，根据检测器的灵敏度及线性要求，用水稀释成适用浓度的混合标准系列溶液，待测。

1.3 仪器条件。

1.3.1 Agilent 7694E/Headspace Sample 炉温:80℃，进样环温度:90℃，传输管温度:100℃;GC循环时间:5 min，样本预热时间:30 min，加压时间:0.2 min，进样时间:1 min。

1.3.2 Agilent 6890N/ALS Chemstation 进样口:温度200℃，分流比6:1;色谱柱:毛细管柱DB－WAX 30m* 0.32mm 膜 厚 0.5μm，流 速1.5mL/min;炉箱:温度90℃，程序时间3min;检测器:温度200℃，H2流速30.0 mL/min，压缩空气流速350mL/min，氮气补气流速20mL/min。

1.4 标准曲线的绘制。取1.0 mL混合标准溶液，置10mL顶空瓶中，准确加入超纯水1.0mL，同时加入0.76gNaCl，立即盖上瓶盖轻轻摇匀，在设定的顶空及色谱条件下进行分析。根据保留时间定性，以峰面积对浓度分别绘制丙酮和异丙醇的标准曲线。

1.5 样品处理。称量样品1.0g(精确至1mg)，置10mL顶空瓶中，准确加入超纯水1.0mL，同时加入0.76gNaCl，立即盖上瓶盖轻轻摇匀，在设定的顶空及色谱条件下进行分析。

2 结果与讨论

2.1 定性分析。参考分析目标物 (荷兰 Dutch Ophthalmic Research Center International B.V.公司生产的 Vision Blue0.5mL瓶装染色剂，成分为0.1%台盼蓝磷酸盐缓冲溶液)的性质和安捷伦气相色谱柱应用说明。初选实验条件:顶空平衡温度100℃、平衡时间60min、进样温度105℃，传输线温度120℃、进样时间0.05min，毛细管柱DBWAX 30m*0.32mm膜厚0.5μm，初温50℃保持2 min、10℃/min升温至230℃保持5 min程序升温，柱流速1.5mL/min，气化室温度200℃、分流比6:1，检测器250℃。

样品在5min前完全出峰，参考相关有机溶剂的气相色谱图，用标准有机溶剂定性出样品中残留的是丙酮和异丙醇两种化学助剂。

2.2 定量分析。

2.2.1 顶空条件的选择。

平衡温度。依据测定物的沸点来选择顶空平衡温度。将20μg/mL丙酮、异丙醇对照液分别在60℃、70℃、80℃、100℃ 温度下平衡30 min后进行测定，得到峰面积与平衡温度间的关系 (见图1)。试验中发现，在相同的平衡时间条件下，随着样品平衡温度的升高，进入气相的丙酮和异丙醇的量增加，从而提高分析的灵敏度。但平衡温度过高时顶空瓶的气密性变差，影响方法的精密度，所以实际工作中一般在满足灵敏度的前提下尽量选择较低的平衡温度。本研究中，设定平衡温度为80℃。

图1 平衡温度对萃取效率的影响

平衡时间。平衡时间取决于被测组分分子从样品基质到气相的扩散速度，即与分子大小、介质黏度及温度有关。设定平衡温度为80℃，分别测定平衡时间为20min，30min，40min，50min，60min时上述对照液的峰面积，结果显示，平衡时间少于30 min时，随着时间的增加，峰面积明显增加;当平衡时间超过30 min时，峰面积增幅趋缓，顶空的气－液两相已基本达到平衡。故本研究中顶空平衡时间选择30 min。

基质效应的消除和减少的方法、顶空气体中各组分的含量除与其本身的挥发性有关，还与样品的基质有关，如丙酮和异丙醇易溶于水，与水存在较强的相互作用，因而富集效率低，较高的平衡温度还会造成大量的水蒸气。选择加入0.76g氯化钠具有提高溶液的离子强度、降低有机化合物在水中溶解度的作用，可以有效地消除样品的基质效应，从而准确进行定量分析。

2.2.2 色谱条件的选择。根据丙酮和异丙醇的结构性质及相关资料，通过实验，我们选择毛细管柱DB－WAX 30m*0.32mm膜厚0.5μm。在进样口温度200℃、FID检测器温度200℃的条件下选择炉箱恒温90℃，柱流速1.5mL/min，分流比6:1。丙酮2.3 min出峰，异丙醇2.5min出峰，各峰的分离度和理论塔板数见表1。

表1 对照品气相色谱分析数据

2.3 方法学验证。

2.3.1 校准曲线、线性范围及检出限。在分析确认的色谱条件下测定丙酮和异丙醇混合标准系列的峰面积，绘制标准曲线。以信噪比S/N=3对应检出限，将5倍的检出限作为方法定量下限见表2。

表2 各成分校准曲线回归方程、线性范围、检出限及定量限

2.3.2 精密度及准确度。配制10μg/mL的丙酮和异丙醇标准溶液试样进行6次测定。丙酮含量平均值为 9.314μg/mL，精密度 (RSD)为 3.507%，回收率 96.5%;异丙醇含量平均值为10.376μg/mL，精密度 (RSD)为2.926%，回收率98.8%，结果表明精密度准确度良好。

2.3.3 加标回收率试验。取同一样品3份，分别加入3种不同浓度标准溶液，测定丙酮和异丙醇浓度。结果显示80%、100%、120%的样品回收率，分别为丙酮为90～95%，异丙醇为89～95%，(n=6)。表明回收率情况良好。

2.4 样品测定。分别对2个不同批号蓝域染色剂中的丙酮、异丙醇残留量按照外标法进行测定，测定结果见表3。

表3 眼科手术蓝域染色剂化学助剂残留量测定结果

3 结论

本实验曾采用对样品先进行蒸馏，收集馏出液直接进样法。该样品预处理回收率低，且长期直接进样，样品馏出液溶剂水会降低毛细管柱柱效。因此本实验采用顶空进样法，以水为溶剂，不仅可以延长柱子的寿命，而且空白对照液没有杂质峰。同时，该方法样品前处理操作简便、方法的线性范围宽、精密度好、准确度高、快速灵敏，适宜长期对染色剂进行质量控制。

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