中心组合设计优化东方拟无枝酸菌发酵生产万古霉素的微量金属离子

彭 哲，张嗣良

(华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237)

万古霉素是由东方拟无枝酸菌(Amycolatopsisorientalis)产生的一种糖肽类抗生素，对青霉素 G和多种抗生素耐药的金黄色葡菌球菌、表球菌以及溶血性链球菌、草绿色链球菌、肺炎球菌及肠球菌等均有强大的抗菌作用，对厌氧的难辨梭状芽孢杆菌亦有较好的抗菌作用，对炭疽杆菌、白喉杆菌等亦敏感[1]。20世纪80年代随着β-内酰胺类抗生素的大量使用，由甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)所引起的感染逐渐流行，万古霉素是目前临床上用于治疗由MRSA引起的严重感染疾病的重要药物，愈来愈引起人们的重视[2]。无机盐在万古霉素的发酵生产过程中有着显著的作用[3]，培养基中加入CaCl2、CuSO4·5H2O可以促进万古霉素的产生[4]；不同的微量金属离子对万古霉素的产生影响不同；亮氨酸、酪氨酸、天冬氨酸是万古霉素的前体物质[5]。

对发酵过程金属离子的筛选优化方法有很多。部分因子设计法是一种2水平的实验设计方法，能够通过比全因子实验次数少得多的实验，从大量影响因子中筛选出重要的因子，根据实验数据拟合出一次多项式，然后通过最速上升实验(Steepest ascent design)确定最大响应区域，以便利用响应面法进一步优化[6]。

中心组合设计是在全因子设计或部分因子设计的基础上添加2k个轴向点和中心点，以得到更为精确的实验预测模型[7]。

付启伟等[8]应用26-2部分因子设计法优化了StreptomycesspiramyceticusWSJ-1-195发酵生产必特螺旋霉素的基础培养基，必特螺旋霉素的效价从173 μg·mL-1提高到 1880 μg·mL-1。熊智强等[9]应用中心组合设计对链霉菌702摇瓶培养红谷霉素进行了优化，发酵液红谷霉素效价达到1500 μg·mL-1，比优化前提高了3.08倍。

作者在此依次通过部分因子析因设计、最速上升实验、中心组合设计，并利用统计学软件 Minitab对实验数据进行分析，确定东方拟无枝酸菌发酵48 h生产万古霉素的培养基中微量金属离子的浓度，以期为万古霉素的工业化生产奠定基础。

1 实验

1.1 菌种

东方拟无枝酸菌(Amycolatopsisorientalis) V-0704由华北制药华胜公司提供。

1.2 培养基

分离平板(斜面)培养基，即高氏1号合成培养基(g·L-1)：可溶性淀粉20，NaCl 0.5，KNO31，K2HPO4·3H2O 5，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，琼脂粉 15，pH值7.2～7.4。

种子培养基(g·L-1)：酵母粉 3，麦芽提取物 3，蛋白胨 11，葡萄糖 17，pH值6.8。用工业用水配制。

发酵培养基(g·L-1)：麦芽糖20，葡萄糖15，玉米油15，酵母粉0.568，棉籽饼粉6.98，黄豆饼粉23.3。用工业用水配制，0.1 MPa、121℃下灭菌20 min。

1.3 培养方法

分离平板培养条件：培养温度28℃，培养时间依菌落的生长情况而定。

种子摇瓶培养条件：培养温度28℃，装液量40 mL/750 mL，摇床转速220 r·min-1，培养时间22～24 h(视菌体生长情况而定)，采用孢子接种培养。

发酵摇瓶培养条件：培养温度33℃，装液量20 mL/250 mL，接种量6%，摇床转速250 r·min-1，培养时间72 h。

1.4 检测方法

取发酵液5.0 mL于100 mL容量瓶中，用pH值1.8的硫酸稀释定容至刻度，摇匀，用双层定性中速滤纸过滤；再用0.45 μm的微孔滤膜过滤。滤液用于HPLC检测。

2 结果与讨论

2.1 25-1部分因子析因设计

在单因子实验确定好因子及其范围的基础上进行2水平筛选实验。

当2k析因设计的因子个数增加时，所需的实验次数会迅速增加。本实验若选用25析因设计需要设计32次实验。部分因子析因设计是合理地假定某些高阶交互作用可被忽略，而主效应和低阶交互作用的信息可以通过只做完全析因实验的一部分求得。25-1部分因子析因设计是在2水平实验设计采用有5个实验因子的每个实验组合重复2次的1/2部分实验设计。是在忽略三阶以上的相互作用的基础上进行，它可以在考察单个因子的效用及2因子的效用时没有偶联重叠的相，并且每个组合重复了2遍，这样可以估计由略微不同的实验条件导致的实验误差。以实验误差为基准，确定数据分析中观测到的差异是否为统计学意义的不同。这对于实验因子的筛选十分重要[7]，本实验采用的设计完全符合实验的要求。

本实验尝试利用25-1部分因子析因设计从所选的5个因子(5因子的编码与实际浓度见表1)中筛选出对效价影响最显著的几个因子，再对所选出的因子进行更为细致的优化，25-1部分因子析因设计结果见表2。

表1 25-1部分因子析因设计的因子编码与实际浓度

表2 25-1部分因子析因设计结果

对25-1部分因子析因设计用Minitab统计学软件在置信度为95%下进行方差分析，以P值<0.05认为有显著作用，结果见表3。

表3 25-1部分因子析因设计的方差分析

由表3可以看出，在忽略三阶及更高阶交互作用的情况下，Co2+及Mo6+有显著作用。由于Co2+、Mo6+的效用显示为负值，因此下一步选取Co2+、Mo6+为主要因素进行最速上升实验时要向金属离子浓度减小的方向进行。

2.2 确定方向的全因子实验

为确定Co2+、Mo6+两因子的搜索方向，进行22的全因子实验，并增加5次在中心点的实验作为曲面曲度的验证。其它因子的浓度都固定在中心点。确定方向的全因子实验的因子编码与实际浓度见表4，结果见表5，方差分析见表6。

表4 确定方向的全因子实验的因子编码与实际浓度

表5 确定方向的全因子实验结果

表6 确定方向的全因子实验的方差分析

由表6可以看出，交互作用和二次项都不显著，而线性非常显著，弯曲的P值大于0.05，可以认为此设计并没有位于弯曲的曲面上，并且Co2+、Mo6+对响应的影响有可加的效应。对数据进行规范变量的一阶模型拟合，结果发现，该模型的相关性很好，失拟不显著，故确定该模型能很好地拟合实验数据。

拟合的一阶模型为：Y(U·mL-1)=3175-61.5X3-71.25X4+8.7X3X4。

2.3 最速上升实验

拟合的一阶模型中Mo6+、Co2+的系数都是负的，因此要离开设计中心沿最速上升路径移动，就要沿Co2+、Mo6+浓度减小的方向移动。设Mo6+的步长为λ1，由公式λ2=61.5λ1/71.25可求出Co2+的步长λ2。

最速上升实验结果见表7。

表7 最速上升实验结果

由表7可以看出，由原点向浓度减小的方向搜索时，从原点到(原点+5λ)实验组效价逐渐升高，然后下降，认为最优点在(原点+3λ)～(原点+7λ)之间。因此，选择1.5×10-5～3.5×10-5g·mL-1金属离子进行中心组合设计。

2.4 中心组合设计

中心组合设计的因子编码与实际浓度见表8。

表8 中心组合设计的因子编码与实际浓度

表9是带有4个轴向点、5个中心点的可旋转的中心组合设计结果，方差分析见表10。

表9 中心组合设计结果

表10 中心组合设计的方差分析

由表10可以看出，模型的失拟P值大于0.05，所拟合的规范变量的二次多项式失拟很小，98.2%的数据可以用该模型来解释。

中心组合设计响应面图见图1。

图1 中心组合设计响应面图

3 验证实验

由模型通过Minitab统计学软件计算得到Mo6+、Co2+的最佳浓度为2.486×10-5g·mL-1，效价预测值为4947.31 U·mL-1。

对比添加金属离子及未加金属离子的摇瓶培养结果，如表11所示。

表11 金属离子添加与否对万古霉素效价的影响

由表11可知，添加金属离子摇瓶培养72 h的万古霉素平均效价达到4946 U·mL-1，较未加金属离子提高了17%。

4 结论

利用25-1部分因子析因设计考察了所选的5种微量金属离子对万古霉素的影响，筛选出Mo6+、Co2+为主要的影响因子；然后通过最速上升实验确定了Co2+、Mo6+的适宜浓度范围；在此基础上利用中心组合设计确定Co2+、Mo6+的最佳浓度为2.486×10-5g·mL-1，并对此结果进行了验证。优化后东方拟无枝酸菌摇瓶培养72 h后的万古霉素平均效价从4206 U·mL-1提高到4946 U·mL-1，提高了17%。

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