高效液相色谱法同时测定豨莶草中豨莶苷和奇壬醇

许凤清， 刘金旗， 王举涛， 黄金萍， 张 娟

(安徽中医学院药学院/安徽省中药研究与开发重点实验室，安徽合肥230038)

豨莶草为常用中药，始载于唐代《新修本草》，《中国药典》2010年版收载菊科植物豨莶Siegesbeckia orientalis L.、腺梗豨莶Siegesbeckia pubescens Makino.和毛梗豨莶Siegesbeckia glabrescens Makino.的地上干燥部分，具有祛风湿，利筋骨的功能。临床上主要用于风湿痹痛、腰膝酸软、四肢麻痹、半身不遂、风疹湿疮等症。近年来研究发现豨莶草在心血管系统、抗炎、降压扩张血管、微循环系统、免疫系统以及抗早孕方面均显示良好的活性［1-7］。其主要成分为二萜类化合物，包括豨莶苷、奇壬醇、豨莶苷元、豨莶萜内酯等［8］，总萜类成分定量测定采用紫外分光光度法［9］。目前，奇壬醇作为其定量检测标准［10］，本实验通过HPLC法检测豨莶草中另一主要活性物质豨莶苷来完善豨莶草的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪(岛津LC-20AT);SPD-20A紫外检测器;N2010色谱工作站;AS3120型超声清洗器(Autoscience公司);CP2115D电子天平(Sartorius公司)。

1.2 试药 豨莶苷对照品(由安徽中医学院药学院天然药化教研室［11］自制);奇壬醇对照品(中国药品生物制品检定所111726-200601);乙腈、甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。豨莶草分别收集和采购于安徽省各不同中药材产地，由安徽中医学院中药资源教研室刘守金教授鉴定。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈-甲醇-0.05 mol/L 磷酸二氢钾水溶液(24∶6∶70);体积流量:1.0 mL/min;柱温:30 ℃;检测波长:215 nm;进样量:20 μL。该色谱条件下豨莶苷、奇壬醇达到基线分离，色谱图见图1。

图1 对照品(A)和亳州饮片厂豨莶草(B)HLPC图谱

2.2 对照品溶液的制备 精密称取豨莶苷、奇壬醇对照品1.68 mg、2.66 mg，分别置于 10 mL 量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取5.0 mL对照品溶液，置10 mL量瓶，甲醇稀释至刻度，得混合对照品溶液。豨莶苷质量浓度为84 μg/mL，奇壬醇质量浓度为 133 μg/mL。

2.3 供试品溶液的制备［12］精密称取豨莶草粉末1 g，置索氏提取器，加沸程60～90℃的石油醚浸泡过夜，连续回流5 h，冷却，取出滤纸筒，挥尽石油醚，转移到100 mL的烧瓶，精密加入甲醇50 mL，称质量，加热回流2 h，放置至室温，再次称质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品试液。

2.4 线性关系考察 精密移取豨莶苷和奇壬醇混合对照品贮备液 1、2、4、8、10、20 μL，按 2.1 项色谱条件进行测定，记录峰面积，以对照品进样质量X(μg)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。得豨莶苷回归方程为 Y=843867X －34778，r=0.9998，在 0.084 ～1.68 μg 范围内呈良好的线性关系;奇壬醇回归方程为 Y=1615648X+8592，r=0.9999，在 0.133 ～2.66 μg 范围内呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 按2.3项下方法制备的供试品溶液(亳州饮片厂)重复进样6次，记录峰面积，测定豨莶苷、奇壬醇，RSD值分别为1.20%、1.05%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验考察 取豨莶草样品(亳州饮片厂)供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12 h 进样，按上述条件测定，记录峰面积，测定豨莶苷、奇壬醇，RSD分别为 1.52%、1.64%，说明样品在12 h内稳定。

2.7 重复性试验 取豨莶草样品(亳州饮片厂)，精密称定6份，置索氏提取器中，按照2.3项下操作，测定豨莶苷、奇壬醇，RSD值分别为1.82%、2.03%，表明方法的重复性较好。

2.8 加样回收试验 取已知豨莶苷和奇壬醇质量分数(分别为 0.357%、0.053%)的亳州饮片厂豨莶草 0.5 g，精密称定。按照2.3项下方法脱脂后，每3份为1组分别加入80%、100%、120%量的豨莶苷和奇壬醇对照品后，按2.3项下方法制备供试品溶液，按上述的色谱条件测定，记录峰面积，计算豨莶苷、奇壬醇的平均回收率和 RSD分别为98.44%，2.27%和 100.58%，2.42%。结果见表1。

表1 豨莶苷、奇壬醇加样回收试验结果 (n=9)

2.9 样品测定 按2.3项下方法制备样品溶液，分别进样检测，并记录豨莶苷和奇壬醇峰面积，经计算，结果见表2。

3 讨论

3.1 在样品处理的过程中，程志宏等［12］曾采用石油醚脱脂法处理豨莶草叶片中大量叶绿素，取得较好的效果;豨莶苷分离工作中发现豨莶草中富含大量的盐，且豨莶苷在甲醇中的溶解度不佳，本实验采用的样品处理方法达到HPLC样品处理要求。同时考察了甲醇-水，乙腈-水，甲醇-磷酸盐，乙腈-磷酸盐溶液等流动相，最终确定乙腈-甲醇-0.05 mol/L KH2PO4(24∶6 ∶70)，体积流量为1.0 mL/min，分离效果良好，豨莶苷、奇壬醇分别在17 min、24 min左右出峰，分析快速准确，重复性好，回收率高，是测定豨莶草中有效成分的理想方法。

表2 豨莶草中豨莶苷、奇壬醇的测定结果 (n=2)

3.2 通过实验发现，安徽省各产地豨莶草中豨莶苷的质量分数在0.017% ～0.379%之间，平均质量分数为0.18%，奇壬醇的质量分数在0.009% ～0.141%之间，平均质量分数为0.067%，不同种类豨莶草中豨莶苷、奇壬醇质量分数变化并无规律;不同产地豨莶草中二者质量分数相差也较大且不成比例关系。

3.3 豨莶苷是豨莶草中有效成分之一，质量分数较高，以葡萄糖苷的形式存在于豨莶草植物体中，通过文献研究发现豨莶苷仅为豨莶草所独有，专属性强。因此，建议在豨莶草的质量标准中增加豨莶苷并结合奇壬醇共同控制豨莶草的质量。

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