复方丹参片对急性脑缺血大鼠药理作用的探讨1）

覃仁安，张超群，余小平，胡 华，周德生

复方丹参片主要由丹参、三七、冰片等组成。具有活血化瘀、理气止痛等功效，临床用于胸中憋闷、心绞痛，疗效良好［1］。目前复方丹参片在治疗脑缺血方面的实验报道为数不多，治疗机制不详。本研究采用Longa改良栓线法造成大鼠急性局灶性脑缺血模型，观察复方丹参片对急性脑缺血大鼠治疗效果，探讨复方丹参片治疗急性脑缺血大鼠的药理作用。

1 资料与方法

1.1 实验动物及药品 健康雄性Sprague－Dawley（SD）大鼠（湖南中医药大学动物实验中心提供，清洁级）约190只，体重（205±10）g。复方丹参片由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供（批准文号：国药准字Z44023372）。灌胃剂量相当于生药0.630g／kg，为成人剂量的7.0倍。血栓通胶囊（批准文号：国药准字Z20025972），产自黑龙江省珍宝岛制药有限公司哈尔滨分公司，每粒装0.18g（含三七总皂苷100mg）。

1.2 急性脑缺血动物模型的建立 参照Longa等腔内线栓法［2］。动物清醒后具备同侧Horner氏征为研究对象。

1.3 分组与方法 将大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、血栓通胶囊组、复方丹参片组。正常组不造模，假手术组不插线，其余步骤与模型组相同。分别于24h，3d，7d等时间点灌胃。正常组蒸馏水10mL／kg灌胃。模型组造模成功后，蒸馏水10mL／kg灌胃。血栓通胶囊组、复方丹参片低剂量组和复方丹参片高剂量组均各自在急性脑缺血大鼠造模前1h灌胃，以后每隔12h灌胃1次。分别在各时间点结束后观察神经功能缺损评分，取脑组织，进行相应指标检测。

1.4 检测指标 在造模灌胃后24h、3d、7d观察大鼠活动情况、反应状况等一般症状。神经功能缺损评分，按照Zausinger六分法［3］。缺血脑组织和对侧相应部位脑组织的病理学检查（HE染色）。梗死体积百分率：TTC染色。将染色后脑组织切片摄影输入计算机，AutoCAD软件计算每个大脑8个脑片16个平面脑梗死面积和损伤侧总面积，以梗死面积占损伤侧大脑总面积的百分比作为统计参数。血管新生相关蛋白指标测定，血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的检测采用免疫组织化学（ABC法）；血管生成素（Ang）－1、Ang－2的检测阳性表达的部位采用Image－Pro Plus（IPP）图像处理系统进行分析，400倍高倍镜下每张切片随机选择10个视野观察，结果以积分光密度值（IOD）表示，取其平均光密度值。

2 结 果

2.1 神经功能缺损评分 非治疗组在各个时间点神经功能缺损评分无显著变化。治疗组评分随着时间的推移逐渐提高，且复方丹参片组评分高于其余组。详见表1。

表1 各组神经功能缺损评分及脑组织梗死面积比较（±s）

表1 各组神经功能缺损评分及脑组织梗死面积比较（±s）

组别 n 神经功能缺损（分） 梗死面积（%）正常组24h 10 5.00±0.00 0.05±0.01 3d 10 5.00±0.00 0.03±0.05 7d 10 5.00±0.00 0.00±0.04假手术组24h 10 5.00±0.00 1.00±0.01 3d 10 5.00±0.00 0.01±0.02 7d 10 5.00±0.00 0.08±0.04模型组24h 10 1.00±0.45 46.01±0.09 3d 10 0.95±0.11 47.22±0.01 7d 10 0.60±0.21 46.02±0.02血塞通胶囊组24h 10 1.53±0.45 46.92±0.02 3d 10 1.65±0.56 46.02±0.612）7d 10 1.60±0.53 44.03±0.132）复方丹参片组24h 10 1.43±0.411） 48.01±0.08 3d 10 1.85±0.781） 46.00±0.022）7d 10 2.13±0.651） 41.00±0.122）与血塞通胶囊组比较，1）P＜0.05；与假手术组比较，2）P＜0.01

2.2 各组TTC染色法测脑梗死面积 脑组织TTC染色后，正常组织染成红色，梗死灶染成白色。大脑中动脉缺血再灌注后，梗死灶位于左侧额叶、顶叶、颞叶皮层及新纹状体外侧部。正常组和假手术组大鼠的大脑切片经TTC染色后未发现有脑梗死现象，模型组在三个时间点后的梗死面积无显著变化。模型组、血塞通胶囊组和复方丹参片组在24h后梗死面积无统计学意义。在3d和7d后血塞通胶囊组和复方丹参片组梗死面积均有不同程度的缩小，其中复方丹参片组梗死面积减少更为显著（P＜0.05）。详见表1。

2.3 缺血脑组织和对侧相应部位脑组织的病理学检查 正常组、假手术组在3个时间点脑组织病理形态学无明显改变，神经元排列整齐，结构清晰，细胞核核膜完整，核仁明显。模型组、血塞通胶囊组、复方丹参片组1d，光镜下可见脑神经元、神经胶质细胞结构清晰、正常，未见脑水肿和其他病变，3d、7d后均有不同程度的脑皮质和侧脑室旁多发性软化灶形成，部分脑组织小血管中可见血栓栓子，软化灶周围脑组织水肿明显。此病理性改变以模型组为重。造模后3d，模型组脑水肿仍很明显，软化灶内还可见较多格子细胞；血塞通胶囊组软化灶内格子细胞更多，神经元有不同程度的变性、坏死、脱失，并可见神经元被吞噬现象，神经元数量减少，并在其周边区部位有小胶质细胞反应。这种现象在复方丹参片组也会发现，但是相对比较轻微。模型组、血塞通胶囊组、复方丹参片组7d，模型组部分大鼠脑内有软化囊肿形成，囊壁有胶质细胞增生、肉芽组织形成，部分大鼠脑组织中可见较多的格子细胞，也有部分大鼠脑组织内有肉芽瘢痕形成。复方丹参片组除少数大鼠脑内有未完全机化的软化灶以外，大部分可见肉芽瘢痕形成，在保护神经元与增强病变修复方面作用均较明显。

2.4 血管新生因子的表达 正常组、假手术组大鼠脑组织梗死灶周围对应部位仅有少量的VEGF、bFGF表达，主要为为黄褐色胞浆着色。模型组、血塞通组、复方丹参片组表达增加，VEGF蛋白阳性表达主要在神经胶质细胞，其次为神经细胞及血管，梗死灶周围较核心显著；bFGF在正常脑组织皮层低水平表达。bFGF蛋白在星形胶质细胞表达水平较高，在神经细胞表达较弱。二者的阳性表达在3d后达到高峰，7d后显著下降。复方丹参片组的阳性表达明显优于血塞通胶囊组（P＜0.05）。显微镜下观察Ang免疫组化染色结果显示，正常大鼠脑内几乎所有区域均为淡棕色，其中缺血边缘组织染色较强。模型组大鼠脑缺血24h后大脑中动脉供血区皮层表达明显增强（OD值0.204 01）；3d后Ang在上述区域表达进一步升高，达到最高值（OD值0.2491）；7d后大鼠上述区域Ang表达仍明显高于正常组（OD值分别为0.214 00和0.210 02），但较再灌注24h组有所降低；在药物治疗组大鼠缺血区缺Ang表达更明显。复方丹参片组Ang表达在3d组和7d组均明显高于血塞通胶囊组（P＜0.05）。详见表2、表3。

表2 VEGF、BFGF在各组鼠大脑白质的表达（±s）

表2 VEGF、BFGF在各组鼠大脑白质的表达（±s）

组别 n VEGF BFGF正常组24h 10 1.00±0.11 1.00±0.41 3d 10 0.00±0.01 1.00±0.12 7d 10 0.10±0.02 2.00±0.03假手术组24h 10 1.15±0.40 1.05±0.12 3d 10 0.16±0.21 1.76±0.51 7d 10 0.26±0.42 1.01±0.55模型组24h 10 19.55±1.01 17.01±0.59 3d 10 20.11±0.42 19.23±0.57 7d 10 20.35±0.87 15.95±0.33血塞通胶囊组24h 10 29.36±1.01 19.41±0.45 3d 10 32.65±1.04 22.96±0.57 7d 10 30.53±3.13 17.99±0.48复方丹参片组24h 10 30.56±1.261） 18.01±0.131）3d 10 35.96±1.561） 25.36±0.441）7d 10 21.75±0.361） 21.56±2.45与模型组比较，1）P＜0.05

表3 Ang－1、Ang－2在各组鼠大脑白质的表达（IOD sum）

3 讨 论

中医学认为缺血性中风是各种致病因素作用下发生的“脑络瘀阻”，其病理因素有风、火（热）、痰（饮）、瘀、毒五种，病理关键是瘀血。治疗性血管新生能有效地恢复脑组织血供，促进神经发生、神经营养、神经保护和抗凋亡。活血可祛瘀，瘀血去则新血生，称之“祛瘀生新”。“生新”不仅是传统意义上的生新血，而且还包含有“生新络”的含义，瘀血去，则新血及新络生，生新又反过来促进瘀血的祛除。

血管新生是指在机体生长发育过程中或创伤修复、缺血缺氧和炎症等情况下原有微血管内皮细胞经过生芽、迁移、增殖与基质重塑等形成新毛细血管的过程［4］。VEGF具有特异性促内皮细胞有丝分裂和血管生长的作用，且依据其浓度不同发挥的作用也不同，低浓度时血管新生占优势，高浓度时血管发生占优势［5］。bFGF是一种多效能的细胞生长因子，bFGF能在细胞周期的转换中诱导并促进G0、G1期细胞进入S期，从而实现成纤维细胞、上皮细胞和血管内皮细胞的快速增殖与分化［6］。血管生成素是一组分泌型的细胞因子，该细胞因子家族在血管重塑、胚胎血管发育、癌症等研究热点中起着重要作用，具有很强的诱导新血管生成［7］，在血管生成过程中其调节和引导作用，防治血管畸形的发生。脑缺血患者脑内新生血管数目越多则生存时间越长［8］。

本实验证明，复方丹参片可提高急性脑缺血大鼠神经功能缺损评分，改善缺血组织的病理形态，缩小脑梗死面积，提高缺血脑组织的血管内皮生长因子（VEGF、bFGF）和血管生成素（Ang－1和Ang－2）水平，初步考虑复方丹参片以增加血管新生因子来促进新生血管形成，但其具体作用机制及其环节，还需进一步研究证实。

［1］曾昭枝.复方丹参片伍用阿司匹林治疗中老年人心肌缺血的临床观察［J］.中国当代医药，2010，6（6）：80.

［2］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats ［J］.Stroke，1989，20（1）：84－91.

［3］Zausinger S，Hungerhuber E，Baethmann A，etal.Neurological impaiment in rats after transient middle cerebral artery occlusion a comparative study under various treatment paradigms ［J］.Brai Res，2000，863（1－2）：94－105.

［4］Michael simons modern condepts in angiogenesis michael simons dartmouth medical school，USA Gabor m rubanyi cardium therapeutics inc，USA imperial［J］.College Press，2007，430.

［5］张爱梅，李宪章，王纪佐.血管内皮生长因子治疗缺血性脑血管病［J］.国外医学：脑血管疾病分册，2008，11（10）：4.

［6］Nugent MA，Iozzo RV.Fibmblast growth flactor［J］.Int J Biochem＆ Cell Biology，2009，32（2）：115.

［7］Kim I，Kim HG，Moon SO，etal.Angiopoletln－1induces endothelial cell sprouting through the activation of focal adhesion kinase and plasmin secretion［J］.Circ Res，2000，86：952－956.

［8］Krupinski J，Kaluza J，Kumar P，etal.Role of angiogenesis in patients with cerebral isehemie stroke ［J］.Stroke，2006，25：1794－1798.