SYK基因激活对人胃癌SGC7901细胞株VEGF表达的影响

于庆功,郑清华,李明强,舒 敏,王 伟,刘春英

(大连大学附属中山医院消化科,辽宁大连116001)

在我国,绝大部分胃癌患者就诊时已属晚期,其治疗难点之一是如何预防和治疗肿瘤的转移。脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)是B细胞信号转导途径中重要的激酶,与T细胞的ZAP-70属于同一个PTK家族,在T细胞和B细胞的成熟、活化、免疫应答的过程中起关键作用[1]。有研究认为Syk不但是免疫调节因子,对恶性肿瘤的生长和转移也可能有抑制作用[2]。国内外研究已证实,Syk能够抑制乳腺肿瘤细胞的生长和转移,Syk基因的表达降低或缺失与正常乳腺组织向恶性细胞发展有关[3]。有研究认为Syk基因是胃癌的抑制基因[4],其表达缺失与胃癌的发生以及转移相关,但其缺失的原因至今未明。抑癌基因启动区CpG岛(基因启动子内含有的CpG,C-G相邻,p为二酯键)的甲基化是抑癌基因表达缺失的主要原因之一[5],而甲基转移酶(DAN methyltransferase enxyme,DNMT)抑制剂 5-氮2'-脱氧胞苷(5-aza-CDR)具有逆转SYK基因甲基化的作用[6]。为了进一步研究Syk基因的表达对胃癌的生物学作用,本研究拟探索5-氮2'-脱氧胞苷(5-aza-CDR)能否逆转人胃癌SGC-7901细胞株Syk基因的甲基化,激活的Syk基因是否对胃癌的生长及血管内皮生长因子(VEGF)的表达有抑制作用,从而探讨Syk基因抑制胃癌的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人胃癌SGC-7901细胞株购自中国科学院上海生化所;5-氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-CDR)购自美国Sigma公司,用含氯化钠的磷酸盐缓冲液(pH6.8)配制成贮存液,-70℃保存。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人胃癌SGC7901细胞株常规培养于含10%小牛血清,100 IU/ml青霉素和100 μ g/ml链霉素的RPM1640培养液中,于37℃,5%CO2培养箱中培养。每3-4天用0.25%胰蛋白酶消化传代1次。

1.2.2 MTT细胞增殖实验 取1×105/ml的对数生长期细胞,配成密度为1×104/ml的细胞使用液,分别接种于3块96孔培养板,每块板分5组,每组3复孔,每孔200 μ l,另取3个孔加入不含细胞的培养液100 μ l作为空白调零。在37℃、5%CO2培养箱中培养过夜,细胞完全贴壁后,小心吸弃培养液同时进行分组处理:(1)空白对照组只加培养液;(2)0.5 μ mol/L 5-aza-CDR 组 ;(3)1.0 μ mol/L 5-aza-CDR 组 ;(4)2.0 μ mol/L 5-aza-CDR 组 ;(5)4.0 μ mol/L 5-aza-CDR组(0.5-4.0 μ mol/L为5-aza-CDR在培养液中的浓度)。培养3天后去药,加入培养液继续培养,自去药开始每隔24 h取出一块板,每孔加入0.5%MTT液20 μ l,再培养4 h后,小心吸除孔内液体,每孔加入二甲基亚砜150 μ l,立即置入自动酶标仪中,震荡后于492 nm波长下测定各孔的吸光度值(A492)。

1.2.3 RT-PCR 将密度为1×105/ml的细胞接种于12个25 cm2培养瓶,每瓶10 ml,37℃、5%CO2条件下培养24 h后,弃去原有培养液,PBS溶液冲洗2次。分成4组,每组3瓶,换液后每瓶仍为10 ml。分组情况以及所更换含药培养液中药物终浓度如下:(1)空白对照组只加培养液;(2)0.5 μ mol/L 5-aza-CDR 组 ;(3)1.0 μ mol/L 5-aza-CDR 组 ;(4)2.0 μ mol/L 5-aza-CDR组。培养3天后去药,加入培养液继续培养培养3天。按TRIZOL(Gibco)说明书操作分别提取不同药物浓度作用后的SGC7901细胞总RNA。检测人胃癌SGC7901细胞株Syk基因的表达情况:引物正义链:5'-AAGCAAATGTCAGTCAGTCATGCAGCAG-3'Syk反义链:5'-TCATCCCTCGATATGGCTTC-3',扩增产物大小471 bp,94℃预变性5 min,94℃变性45 s,61℃退火1 min,72℃延伸45 s,30个循环后72℃延伸7 min。扩增产物-70℃保存。检测细胞VEGF的表达:(1)cDNA的合成:oligdT 1 μ l,dNTP 1 μ l,逆转录缓冲液 5 μ l,DEPC-H2O 6.5 μ l,RNA 10 μ l,Rnasin 0.5 μ l,MMV 1 μ l。 置于37℃水浴2 h,95℃5 min。(2)PCR:VEGF上游引物5'-ATGAACTTTCTGCTGTCTTG-3',下游引物5'-TGCATGGTGATGTTGGAC-3',扩增产物大小382 bp,内参β-actin的上游引物为:5'-GGGACCTGACTGACTACCTC-3',下游引物为:5'-ACTCGTCATACTCCTGCTTGCTG-3',扩增产物大小546 bp。VEGF和βactin上下游引物均由大连TaKaRa生物工程公司合成 。PCR 扩 增体系 50 μ l。DEPC-H2O 41.5 μ l,PCR缓冲液 5 μ l,上下游引物各 1 μ l,cDNA 1 μ l,Taq 酶 0.5 μ l。PCR 反应条件:变性95℃45 s,退火95℃45 s,54℃45 s,72℃45 s,循环35次。延伸72℃10 min。扩增产物-70℃保存。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后,将胶板在凝胶成像分析系统下拍照并进行定量分析。电泳过程重复3次,记录定量分析数据。

1.3 统计学处理

根据实验性质,实验数据以均数±标准差(MEAN±SD)表示,数据用SPSS13.0统计软件处理。组间比较用方差分析,P＜0.05认为差异有显著性。

2 结果

2.1 MTT细胞增殖实验

接受5-aza-CDR激活SYK基因作用后的人胃癌SGC7901细胞生长增殖明显受抑,细胞生长增殖受抑制程度在一定药物浓度范围内呈现时间、剂量依赖性。从数据分析中得出,相同时间,1.0 μ mol/L组第 2 天和第 3 天 、2.0 μ mol/L 组和 4.0 μ mol/L 组与对照组相比差异显著(P＜0.01);相同浓度,与第1天相比较 ,1.0 μ mol/L 组第 3 天 、2.0 μ mol/L 组和 4.0 μ mol/L组第2、3天与第1天比较,增殖明显受抑,差异无统计学意义(P＞0.05)。另外,相同时间,对照组 与 0.5 μ mol/L 组相 比 、2.0 μ mol/L 组 与 4.0 μ mol/L组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。结果如表1所示(表1中天数为自去药开始算起)。

表1 MTT法检测经不同浓度5-aza-CDR激活SYK基因后人胃癌SGC7901细胞的增殖情况

2.2 RT-PCR

空白对照组及0.5 μ mol/L 5-aza-CDR组无 SYK目的基因片段表达;1.0 μ mol/L 5-aza-CDR组及2.0 μ mol/L 5-aza-CDR组有SYK目的基因片段表达,扩增产物大小471 bp。4组均有VEGFmRNA的表达,随着5-aza-CDR浓度的升高VEGFmRNA的表达量呈递减趋势。定量分析结果显示:各组SYK表达水平与空白对照组比较,0.5 μ mol/L 5-aza-CDR组P＞0.05;1.0 μ mol/L 5-aza-CDR 组 P ＜0.05;2.0 μ mol/L 5-aza-CDR组 P＜0.01.如图1、表2所示。

图1 各组人胃癌SGC7901细胞Syk mRNA(左)、VEGFmRNA(右)电泳图

表2 各浓度5-aza-CDR组与空白对照组人胃癌SGC7901细胞 VEGFmRNA表达水平(OD值)比较

3 讨论

本实验研究证实,去甲基化前的SGC7901细胞中没有Syk基因的表达,但用5-aza-CDR处理Syk表达阴性的SGC7901细胞后,即能检测到Syk基因的表达。Syk基因及其表达的作用包括抑制肿瘤的生长和转移。Olivier B[7]的研究认为,Syk基因的表达产物可通过促进细胞凋亡抑制肿瘤生长;Ganapati H[7]的研究认为Syk蛋白可通过抑制磷脂酰肌醇激酶活性抑制乳腺癌细胞的运动性。近来的研究认为,Syk是内皮细胞生长的重要调控因素,故本实验利用5-aza-CDR对Syk基因激活的作用,观察Syk基因的激活对人胃癌SGC7901细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响,从而研究Syk基因的激活对人胃癌SGC7901细胞生长和转移的影响。研究发现,用5-aza-CDR去甲基化的SGC7901细胞Syk基因表达激活的同时,SGC7901细胞生长增殖明显受抑,细胞生长增殖受抑制程度在一定药物浓度范围内呈现时间、剂量依赖性。SGC-7901细胞VEGFmRNA的表达相应减少,且随着5-aza-CDR浓度的升高,VEGFmRNA的表达量呈递减趋势。因此,抑制VEGFmRNA的表达可能是SYK基因的激活抑制SGC-7901细胞株的生长和转移的机制之一。除甲基化以外,Syk基因的沉寂有无其它基因及细胞因子的参与,表达缺失的原因等还有待进一步研究。Syk抑制VEGFmRNA的表达以及抑制胃癌的增殖转移具体作用机制尚不清楚,仍待进一步研究,为防治胃癌癌及其他肿瘤提供新的分子学靶位。

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[7]Olivier Bailet,Nina Fenouille,Patricia Abbe,et al.Spleen tyrosine kinase functions as a tumor suppressor in Melanoma Cells by inducing senescence-like growth arrest[J].Cancer Res,2009,69:2748.