细胞色素C及相关细胞凋亡蛋白、基因在原发性肝癌组织表达的临床意义

陈 昊,陈乃玲,张春芳,张 昶,王红霞*,赵文海

(1.连云港市第一人民医院,江苏连云港222002;2.北京军区总医院全军肝病治疗中心)

研究证实凋亡与肿瘤发生发展密切相关,但是内外凋亡通路中各凋亡调控蛋白与肿瘤恶性增殖的关系尚不甚明了。我们以原发性肝细胞癌(肝癌)作为观察对象,研究 Caspase8、Bid 、Bcl-2、Bax、Cyt-C 和Caspase9等凋亡相关蛋白、基因在肝癌细胞的表达,并探讨其临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料来源 标本来自连云港市第一人民医院病理科存档和尸检蜡块,诊断均经病理证实。肝癌组:50例,男 41例、女 9例,年龄 33-74岁、平均(52.84±9.15)岁。其中高分化组8例,中分化组35例,低分化组7例;参照Edmondson分级法进行病理分级[1],其中Ⅰ级4例,Ⅱ级24例,Ⅲ级22例。对照组:正常肝脏组织标本 30例,男 17例、女13例,年龄4-71岁、平均(41.53±18.20)岁。所有组织标本均经10%中性福尔马林液固定,石蜡包埋,4 μ m厚切片。

1.2 试剂 Bax兔抗人多克隆抗体;人 Caspase8 mRNA,Bid mRNA,Bcl-2 mRNA,Cyt-c mRNA和Caspase9 mRNA原位分子杂交试剂盒;免疫组化二抗试剂盒均购自武汉博士德生物有限公司。

1.3 免疫组织化学和原位分子杂交 免疫组织化学和原位分子杂交染色均按照试剂说明书操作,以PBS代替一抗作为空白对照。结果判定及分析:采用半定量积分法判断结果,具体操作如下:每张切片随机选取10个高倍镜视野,分析其阳性细胞数及着色强度。①阳性细胞百分数计分:阳性细胞数≤5%为0分,6%-25%为1分,26%-50%为2分,51%-75%为3分,＞75%为 4分;②着色强度积分,无色为0分,淡黄色为1分,黄色为2分,棕黄色为3分。将①和②两者积分相乘得到总积分,0分为阴性(-),1-4分为弱阳性(+),5-8分为阳性(++),9-12分为强阳性(+++)。

1.4 统计学处理 采用SPSS11.5统计学软件和Excel 2003进行数据统计和分析,运用卡方检验比较各组间阳性表达率的差异,采用秩和检验和独立样本t检验比较各组间表达强度差异。检验水准α取0.05,P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外凋亡通路中Caspase8、Bid的表达 Caspase8、Bid均阳性表达于细胞浆,染色弥散分布(图1-2)。

Caspase8阳性表达率在肝癌组为76.0%(38/50),其中 +8例、++25例、+++5例;对照组为60.0%(18/30),其中 +10例、++6例、+++2例。Caspase8阳性表达率两组间比较差异未见统计学意义(χ2=2.286,P＞0.05);但表达强度肝癌组高于对照组,差异有统计学意义(t=-2.483,P＜0.05)。Bid阳性表达率肝癌组为66%(33/50),其中+7例、++21例、+++5例;对照组为96.67%(29/30),其中+13例、++9例、+++7例。Bid阳性表达率对照组高于肝癌组,差异有统计学意义(χ2=10.112,P＜0.01),但表达强度比较差异未见统计学意义(t=1.833,P＞0.05)。

2.2 内凋亡通路中 Bcl-2、Bax、Cyt-C和Caspase9的表达 Bcl-2、Bax、Cyt-C与Caspase9均阳性表达于细胞浆,染色弥散分布(图3-6)。

图1 Caspase 8在肝癌细胞浆的阳性表达(ISH×400)

图2 Bid在肝癌细胞浆的阳性表达表达(ISH×400)

图3 Bcl-2在肝癌细胞浆的阳性(ISH×400)

图4 Bax在肝癌细胞浆的阳性表达(SP×400)

图5 Cyt-C在肝癌细胞浆的阳性表达(ISH×400)

图6 Caspase 9在肝癌细胞浆的阳性表达(ISH×400)

Bcl-2阳性表达率在肝癌组为38%(19/50),其中+9例、++6例、+++4例;对照组为86.67%(26/30),其中+6例 、++15例 、+++5例 。Bcl-2两组间阳性表达率和表达强度比较差异皆有统计学意义(χ2=18.045,P ＜0.01;t=5.075,P＜0.01),肝癌组低于对照组。Bax阳性表达率在肝癌组为70%(35/50),其中 +24例、++7例、+++4例;对照组为93.33%(28/30),其中 +12例、++13例、+++3例。Bax两组间阳性表达率和表达强度比较差异皆有统计学意义(χ2=6.100,P＜0.05;t=3.296,＜0.01),肝癌组低于对照组。Cyt-C阳性表达率在肝癌组为78%(39/50),其中 +11 例 、++17 例 、+++11 例 ;对照组为63.33%(19/30),其中+6例、++10例、+++3例。Caspase9阳性表达率在肝癌组为66%(33/50),其中 +13例、++15例、+++5例;对照组为80.00%(24/30),其中 +7例、++13例、+++4例。Cyt-C和Caspase9在肝癌和对照组间阳性表达率和表达强度差异均未见统计学意义(Cyt-C:χ2=2.203,P＞0.05;t=-1.593,P ＞0.05)(Caspase9:χ2=1.794,P＞0.05;t=1.513,P＞0.05)。

2.3 肝癌组肝癌凋亡蛋白或基因与肿瘤分化程度、病理分级及有无淋巴结转移的关系 Cyt-C阳性表达率在肝癌高分化组为87.5%(7/8)、中分化组为85.71%(30/35)、低分化组为 28.57%(2/7);中及低分化两组间和高及低分化两组间差异均有统计学意义(P分别＜0.01和＜0.05),但高及中分化两组间差异未见统计学意义(P＞0.05)。Caspase8、Bid、Bcl-2、Bax和Caspase9的表达,在不同肿瘤分化程度、病理分级及有无淋巴结转移组间差异均未见统计学意义(P＞0.05)(表1、2)。

3 讨论

对抗和逃避凋亡是肿瘤发生发展的重要机制[2],因此化疗、放疗和分子靶向治疗都是主要通过诱导凋亡来治疗肿瘤的[3]。已知凋亡分为外源性的死亡受体通路和内源性的线粒体通路[4]。外源性凋亡通路主要是通过死亡受体与配体超家族相结合后激活胞内的Caspase8而诱导凋亡,Caspase8又可切割促凋亡蛋白Bid而激活内源性的线粒体通路促凋亡效应。内源性凋亡通路中Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的两个重要代表成员,Bcl-2家族通过改变线粒体膜电位而使得线粒体孔道开放,进而释放线粒体膜间的促凋亡蛋白Cyt-C,再逐级激活下游的效应Cas-pase9发挥凋亡效应[5]。Bcl-2属于抑凋亡蛋白、Bax是促凋亡蛋白,两者的组成比例决定细胞对凋亡的敏感性[6]。Cyt-C和Caspase9均为促凋亡蛋白。目前研究大都支持在肿瘤的恶性进展过程中,促凋亡蛋白表达降低,抑凋亡蛋白表达增高,从而使肿瘤细胞恶性增殖。但也有部分学者研究证实肝细胞癌组织中存在自发凋亡机制,并且也存在肿瘤细胞恶性程度越高凋亡指数越大的现象[7]。

表1 Cyt-C、Caspase8、Bid在肝癌组织阳性表达与病理分级、肿瘤分化程度、转移的关系

表2 Bcl-2、Bax、Caspase9在肝癌组织阳性表达与病理分级、肿瘤分化程度、转移的关系

本研究发现在肝癌的发生发展过程中,外源性死亡受体通路的促凋亡Caspase8在肝癌细胞表达强度升高,可能缘于肝癌中间质反应明显,抗肿瘤的细胞毒性T细胞(CTL)、自然杀伤细胞(NK)活性强,激活了该通路,也即肝癌早期本就有高凋亡活性。促凋亡蛋白Bid的表达水平肝癌组低于对照组。已知Bid主要通过Caspase8的切割而发挥作用,但为何我们实验得出两者表达是呈负调节的?可能Bid的表达还受其它因素的调控,抑或是因肝癌细胞胞浆中的Bid被已升高的Caspase8切割为有活性的tBid,导致Bid表达下降?具体的机制待进一步研究。

本研究中内凋亡线粒体通路中的促凋亡蛋白Bax在肝癌组较正常组表达下降,促凋亡信号启动减弱。还发现抑凋亡基因Bcl-2表达也呈下降趋势,这与一些研究结论相悖。有研究发现乌苏酸可以通过上调Bax表达,下调Bcl-2表达来诱导肝癌细胞株SMMC-7721促凋亡效应[8]。Ramakrishnan等[9]学者证实在肝癌细胞凋亡过程中,促凋亡蛋白Bax表达上调、抑凋亡蛋白Bcl-2表达下调,两者此消彼长,从而促进肝癌细胞凋亡得以实现。我们分析上述差异的可能原因是在肝癌发生发展过程中,机体特殊的肿瘤内环境决定调节肿瘤生长增殖的机制是复杂多样的,促进和抑制因素并存,而体外实验研究肝癌细胞凋亡的作用因素比较单一。作者认为本研究Bcl-2与Bax变化方向虽一致,但Bcl-2/Bax比例偏倚可能决定以抑凋亡或促凋亡为主。但也有支持我们实验结果的研究,有学者发现在结直肠腺瘤中都有Bcl-2表达,而在癌中却有50%检测不到Bcl-2表达[10]。结合本研究Cyt-C的表达所见推测肝癌细胞Bcl-2/Bax比例可能增高,提示肝癌细胞在内源性线粒体通路是以抑凋亡信号占优势,从而促进肝癌的发生发展。Cyt-C在正常肝组织到肝癌组织的表达差异不明显,但却与肿瘤分化密切相关,即肿瘤分化程度越高,其表达相对增高,可能是因为Cyt-C是在内凋亡线粒体通路的开关分子Bcl-2家族激活后才发挥作用,因此Cyt-C的表达调节应该是肝癌发生过程中的晚期事件。下游的效应Caspase9未见表达差异,可能因其活性发挥是通过与Cyt-C和Apaf-1形成凋亡复合体激活凋亡,不是其单一因素作用之故。

已知CTL和NK细胞可表达和分泌Fas-配体(Fas-L),通过激活体内的外源性死亡受体通路从而清除促肝脏疾病发生发展的一系列异常细胞,如携带肝炎病毒的肝细胞和肝癌细胞[3]。本研究显示在肝癌的发生发展过程中,早期可能是外源性死亡受体通路激活肝癌细胞的高凋亡活性,但同时在癌基因激活、抑癌基因失活等因素的综合作用下,肝癌细胞的生物学活性仍是增殖高于凋亡。随着肿瘤进展,Bcl-2和Bax比例发生动态变化,Cyt-C表达下降,内源性线粒体通路的促凋亡作用减弱导致肿瘤加速发展。提示肝癌的分子靶向治疗在早期可通过加强外源性死亡受体通路的促凋亡作用、进展期则通过从内源性线粒体通路的源头Bcl-2家族着手,应用分子生物学技术上调促凋亡蛋白、下调抗凋亡蛋白而使得Bcl-2/Bax向促凋亡方向发展,促进Cyt-C的释放,进而促进肿瘤细胞凋亡作为临床辅助治疗手段。

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