三种检测系统测定糖化血红蛋白相关性分析及偏倚评估

童华诚,刘 慧,张 美,马敏敏

(南京同仁医院 医学检验科,江苏 南京211101)

糖化血红蛋白是血红蛋白与糖类经非酶促反应结合而成的.它的合成过程是缓慢且不可逆的,其血液浓度反映测定前2-3个月机体平均血糖水平。血液糖化血红蛋白水平被视为糖尿病血糖控制的“金标准”,在临床上得到广泛应用[1]。

目前临床实验室常用的HbA1c测定方法主要是离子交换高效液相色谱法(HPLC)、免疫法及亲和层析法三大主流方法。现阶段,我国临床实验室不同检测系统之间测定HbA1c的结果往往差异很大,临床上难以作出合理评价,应用受到严重限制[2]。

本文针对目前临床上有代表性的三种检测系统测定HbA1c的结果作比较研究,对HbAlc测定值的可比性和偏倚程度予以分析报告。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 收集本院门诊及住院糖尿病患者和健康体检者EDTA抗凝全血,共64份,血标本在采集后6 h内检测完毕。

1.1.2 仪器和试剂 (1)检测系统一:美国Bio-Rad D-10 HPLC糖化血红蛋白分析仪及其原装试剂和校准品(试剂批号:1号液,AA01911;2号液,AA01912;wash液,AA01913。校准品批号:Level 1-AA00927,Level 2-AA00928);(2)检测系统二:瑞士罗氏公司Roche Cobas全自动生化分析仪,免疫法,Roche公司Tina-Quant HbA1cⅡ试剂和校准品(批号:158507-01)。(3)挪威Axis-Shield公司Afinion AS100分析仪,亲和色谱法,原装进口的配套测试卡及校准品(批号:10146319);(5)质控品:检测系统一、二均使用伯乐公司HbA1c质控品(批号:Level 1-33801,Level 2-33802);检测系统三使用Afinion AS100分析仪专用质控品(批号:260311)。

1.2 方法

1.2.1 操作方法 D-10 HPLC法及Afinion亲和色谱法测定糖化血红蛋白为全自动分析,按仪器使用说明书操作;Roche免疫法需要对全血样本进行预处理后上机测定。

1.2.2 相关性分析 参照 CLSI EP9-A2评价方案[3],每天收集新鲜标本8份,分别用4种检测系统对这8份样本按顺序1→8进行样本测定,再按相反顺序8→1重复测定,8天共完成64份样本测定,记录测定结果。HPLC法是目前公认测定HbAlc的参考方法,本试验以D-10离子交换HPLC法测定结果为参照,计算每个样本3种方法测定结果的均值、每个样本3种方法重复测定值间差值的绝对值及其他2种方法(Y)与参考方法测定结果(X)均值间的差值,按EP9-A2文件进行方法内及方法间离群值检查并去除离群值,计算线性回归方程Y=bX+a。参考检测系统(X)的测定范围是否合适,可用相关系数(r)做粗略估计,如r≥0.975(或r2≥0.95),则认为X的分析范围合适,可以用直线回归计算斜率、截距,依据已给定的HbA1c医学决定水平Xc,计算待验证的检测系统(Y)与参考检测系统(X)之间的相对偏差(SE%)。如r＜0.975,则使用配对t检验对测定结果进行分析,并计算出待验证的检测系统与参考检测系统均值的相对偏倚。相对偏倚可接受性判断参照卫生部临床检验中心公布的HbAlc室间质量评估的允许误差,允许偏倚根据公式:(Xc×允许误差)/2计算,Xc为HbA1c的医学决定水平,预期偏倚计算公式:a+(b-1)Xc。计算比对系统(Y)与参考系统(X)之间的相对偏差(SE%)。如果预期偏倚小于允许偏倚则为可接受,否则为不可接受[4]。

1.2.3 不精密度测定 检测系统一和二均使用伯乐公司提供的高低两个水平的质控品,检测系统三Afinion AS100分析仪只适用挪威Axis-Shield公司提供的专用高低两个水平质控品,每批每个浓度双份测定,相隔2 h以上,每天2次,连续测定20天,检测其批内不精密度和批间不精密度。

1.2.4 统计学分析 统计学分析采用Microsoft Excel 2007,SPSS 13.0统计软件。回归分析采用Passing-Bablok回归,回归线性检测采用Cusum方法检测,P＜0.05表示线性回归偏倚有统计学意义。相关性分析采用Pearson相关,P＜0.05表示相关具有统计学意义。偏倚分析采用Bland-Altman方法。

2 结果

2.1 三种检测系统测定糖化血红蛋白相关性和相对偏倚分析结果 对三种检测系统测定64例血液样本HbA1c的数据经方法内离群点的检验及方法间配对结果离群点的检验,均未发现离群点。以D-10 HPLC法测定值(X)为参照,对 Roche免疫法结果(Y)进行回归统计得到方程Y=0.9704X+0.3545,r=0.992,P＜0.01;对Afinion亲和色谱法测定值进行回归统计得到方程Y=1.032X-0.061,r=0.996,P＜0.01,相关系数均大于0.975,P＜0.01,提示Roche免疫法、Afinion亲和色谱法与D-10 HPLC法测定结果具有显著相关性,并表明D-10 HPLC法测定值(X)的分布范围符合要求,可以用b和a作误差的估计(见图1、2)。卫生部临床检验中心公布的HbA1c室间质量评估允许误差为总体均值±20%,根据允许偏倚公式:(Xc×允许误差)/2计算,Xc为HbA1c检测试验的医学决定水平,因此,HbA1c检测的允许偏倚为(6.2%×±20%)/2=±0.62%,依据预期偏倚计算公式:a+(b-1)Xc,Roche免疫法和Afinion亲和色谱法测定结果预期偏倚绝对值分别为0.17%和0.13%,均小于允许偏倚0.62%。

2.2 不精密度测定结果 三种检测系统分别测定高低两个水平的质控品每批每个浓度双份测定,D-10 HPLC法和Afinion亲和色谱法平均总CV分别为2.0%、1.6%和1.7%、1.3%;Roche免疫法测定HbA1c总CV%分别为4.1%和3.7%,约为另外两个检测系统CV%的1倍以上,三种检测系统平均批内、批间和总CV%见表1。

图1 Roche免疫法与D-10 HPLC法线性分析

表1 三种检测系统测定HbA1c(%)的变异系数

图2 Afinion亲和色谱法与D-10 HPLC法线性分析

3 讨论

糖化血红蛋白的测定方法有几十种之多,这些检测方法基本上可分为两大类:一类是基于糖化血红蛋白与血红蛋白电荷不同,如离子交换层析法、电泳法;另一类是基于血红蛋白上糖化基团的结构特点,如亲和层析法、免疫法、离子捕获法和酶法等[2]。各种方法和检测设备测定HbA1c结果的准确度、精密度都有所差异,而实现同一检验项目在不同检测系统之间测定结果的可比性是临床实验室质量管理的最终目标。国际临床化学与检验学联合会(International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,IFCC)于1995年成立了糖化血红蛋白标准化工作组,经过多年研究探索,研发了糖化血红蛋白的参考物质和参考测定方法[5-6],极大地促进了HbA1c测定的标准化进程。

方法学比对试验是实现测量结果准确度溯源和患者标本检验结果可比性的重要途径。本研究参照EP9-A2文件,对三种检测系统测定HbAlc结果进行比对和偏倚评估。本实验结果表明,三个检测系统测定HbAlc的不精密度均符合美国国家糖化血红蛋白标准化项目(NGSP)确定的小于5%的要求。实验方法与参考方法的比对结果可以接受,则可认为实验方法的准确度可以溯源,不同检测系统的检验结果具有可比性。实验检测系统与参考检测系统之间的相对偏倚低于允许偏倚,因此实验检测系统测定HbAlc结果是可靠的,不需要重新校准。

Bio-Rad D-10全自动糖化血红蛋白仪和Afinion AS100分析仪分别使用使用HPLC法及亲和色谱法全自动测定HbA1c,结果不易受到人为因素影响,在临床应用过程中应按照仪器使用手册的指导加强维护保养并定期校准。应用免疫学方法在生化分析仪上测定HbA1c,需要手工吸取血样本与溶血素混合,彻底破坏红细胞后上机测定,易引入人为因素误差来源。本实验表明,免疫法较HPLC法或亲和色谱法总不精密度高出1倍以上,免疫法测定结果应定期与HPLC法或亲和色谱法进行比对。如果使用免疫法检测糖化血红蛋白,应采用多点定标方式,密切关注室内质控结果的变化,确保在试剂的开瓶有效期内使用。如果采用非配套的仪器、试剂和校准品等则应按照CLSI标准化文件要求作自建检测系统的性能验证,以确保检验结果的准确可靠以及与其他实验室、其他检测系统之间结果报告的一致性。

[1]International Expert Committee.International Expert Committee reporton the role of the HbA1c assay in the diagnosis of diabetes[J].Diabetes Care,2009,32:1327.

[2]王冬环,张传宝,陈文祥,等.应重视糖化血红蛋白测定技术及其量值溯源[J].中华检验医学杂志,2008,31:965-968.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI).Method comparison and bias estimation using patient samples[S].ApprovedGuideline-second edition.Document EP9-A2[S].Wayne,PA.2003.

[4]李义龙,单战海,韩 冰,等.酶法糖化血红蛋白试剂盒方法学比对评价[J].中国实验诊断学,2010,14(8):1336.

[5]Jeppsson JO,Kobold U,BarrJ,et al.Approved IFCC reference method for the measurement of HbAlc in human blood[J].Clin Chem Lab Med,2002,40(1):78.

[6]Hoelml W,Weykemp C,Jeppmon JO,et al.IFCC reference system for hemoglobin Alc in human blood and the national standardization schemes In the United States,Japan,and Sweden:method-comparison study[J].Clin Chem,2004,50(1):166.