多药耐药铜绿假单胞菌耐药性及相关耐药基因分析

赵祝香,陈惠玲,魏树全,赵子文,叶惠芬

(广州医学院附属广州市第一人民医院呼吸内科,广东广州510180)

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是下呼吸道感染、ICU感染的首要病原菌,而且可造成一定程度的院内感染流行。我国全国性监测数据显示:从1994年到2009年,PA在所有院内感染的革兰阴性菌中排第1位[1,2]。由于广谱抗生素的广泛应用,所有广谱抗生素对铜绿假单胞菌的敏感性都在下降,目前出现了对3类或3类以上抗生素耐药扔多药耐药铜绿假单胞菌(MDRPA),甚至出现了仅对粘菌素敏感的泛耐药铜绿假单菌(PDRPA),多药耐药成了铜绿假单胞菌感染的一个严重的问题[3]。如2004年北京协和医院报道有44例MDRPA院内感染,死亡 24例,好转 20例,病死率为 55%[4]。多药铜绿假单胞菌的耐药机制十分复杂,目前尚不甚清楚,铜绿假单胞菌膜蛋白oprD基因的缺失、产金属β-内酰胺酶和外排泵MexAB-OprM高表达可能是其主要的耐药机制,本研究以此为基础,选择相关耐药基因为检测对象,了解临床分离的MDRP相关耐药基因的存在情况。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 从广州市第一人民医院2009年01月至2010年10月住院患者临床标本收集铜绿假单胞菌1 394株,利用纸片扩散法筛选出多重耐药的菌株,对3类或3类以上抗菌药物耐药的菌株判定为多重耐药铜绿假单胞菌,共40株,其中从痰液分离菌株32株、中段尿3株、创伤和伤口分泌物5株;按病区分布,老年病科(10)株,中心重症监护病房(8)株、呼吸内科(7)株、神经内科(4)株、泌尿外科(3)株、外科(3)株。质控菌株为大肠埃希氏菌(ATCC35218)和铜绿假单胞菌(ATCC27853),由默沙东公司赠送。

1.1.2 试剂 哌拉西林(PIP)、氨曲南(ATM)、头孢他啶(CAZ)、环丙沙星(CIP)、亚胺培南(IPM)、头孢吡肟(PEP)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、庆大霉素(GEN)8种抗生素药敏纸片,购自英国Oxoid公司。PCR引物由英骏生物技术有限公司(invitrogen)合成具体见表1。细菌基因组DNA提取试剂盒、TaqDNA聚合酶、4种dNTP混合液(25 mmol/L)、DNA 分子量Marker均购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.1.3 仪器 生物梅里埃公司VITEK2全自动细菌鉴定仪,Biometra PCR扩增仪。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验 采用K-B药敏实验。试验操作规程、质量控制和药敏结果判断依据根据2009年美国临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐的标准进行解释。

1.2.2 细菌基因组DNA模板的制备细菌DNA的提取 用接种环挑取纯菌落接种于5 ml LB肉汤培养液,将装有LB培养液的试管置于震荡培养箱中,37℃,200转/分,18-20小时培养至细菌生长对数期。然后取3 ml培养液,按照天跟生化公司的细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明进行操作,提取的DNA模版置于-20℃保存备用。

1.2.3 引物设计和PCR反应条件 PCR引物序列及预期产物大小见表1。

表1 PCR扩增相关耐药基因引物

各种靶基因PCR扩增体系均为:总反应体积20 μ l,其中 P1、P2 引物各 1 μ l,Premix Taq DNA 聚合酶10 μ l,灭菌蒸馏水 7 μ l,模板液 1 μ l。 热循环参数根据目的产物大小有所不同,PCR扩增产物＞500 bq的基因热循环参数为:93℃预变性3 min,93℃变性60 s、退火温度(如表1)退火60 s、72℃延伸 60 s,35个循环后72℃延伸5min;用双蒸灭菌水作模板设阴性对照。反应结束后取5 μ l PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,核酸染液染色,同时加核酸电泳相对分子质量标准鉴定扩增DNA片段的大小。用凝胶成像系统观察结果并照相。

1.2.4 统计学处理 按计数资料进行统计学分析。

2 结果

2.1 多药耐药铜绿假单胞菌的体外药敏结果 40株多药耐药铜绿假单胞菌临床常用抗假单胞菌药物的体外抗菌活性见表2。这些菌株对临床常用的多种药物大部分耐药,耐药率由高到低依次为厄它培南,亚胺培南(IPM)、头孢他啶(CAZ)、美罗培南、头孢吡肟(PEP)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、环丙沙星、氨曲南(ATM)、庆大霉素(GEN)、妥布霉素、阿米卡星、多粘菌素,其中对厄他培南天然耐药,对常用抗假单胞菌抗菌素均大于50%以上,对亚胺培南(IPM)、头孢他啶(CAZ)、美罗培南耐药率均高达90%以上,对多粘菌素B未出现耐药。

表2 多药耐药铜绿假单胞菌体外药敏试验结果

2.2 多药耐药铜绿假单胞菌临床分离株的耐药基因PCR检测

外膜蛋白D2(oprD2)基因检测40株多药耐药铜绿假单胞菌中,oprD2基因缺失26株,缺失率为65.0%,部分oprD2基因阳性菌株PCR扩增产物电泳图谱见图1;整合酶阳性9株,检出率为22.5%;金属酶阳性1株,其PCR扩增产物电泳图如图2、图3;氨基糖苷类修饰酶基因ant3Ⅰ(如图4)、aac6Ⅱ基因多见,ant2Ⅰ、aac6Ⅰ阳性率也较高。同时携带2种或2种以上耐药基因占55.0%,携带2种以上氨基糖苷类修饰基因的有40.0%,耐药基因种类见表3。

图1 外膜蛋白OPRD2缺失基因扩增产物

图2 整合子INTⅠ基因扩增产物

图3 金属酶基因扩增产物

图4 氨基糖苷糖类ant3Ⅰ基因扩增产物

表3 40株铜绿假单胞菌基因型构成

3 讨论

多药耐药铜绿假单菌感染使临床医生抗感染治疗面临选药困难的处境,从我们的药敏结果中可以看到,40株MDRPA对临床常用抗生素的耐药率在100%至22.60%之间,对厄它培南天然耐药,对β内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类均显示出很高的耐药性。头孢他啶和亚胺培南是常见的抗铜绿假单胞菌药物,但耐药率均较高,加上还有一定的中介率,多药耐药铜绿假单胞菌对上述两种抗生素的敏感率不到30%。氨曲南是第一个应用于临床的单环β内酰胺类抗生素,由于对多种质粒介导和染色体介导的β内酰胺酶稳定,常用于需氧革兰阴性杆菌如肠道杆菌和铜绿假单胞菌所引起的各种抗感染治疗[5]。但本研究显示,MDRPA对氨曲南的敏感率仅33.00%,说明临床医生如凭经验选择抗菌素来治疗MDPRA感染,可能导致患者死亡率增加,甚至造成铜绿假单胞耐药菌株的传播。

由于铜绿假单胞菌耐药率不断增加,存在区域差异,目前还不十分清楚,了解多药耐药铜绿假单胞菌耐药的分子机制研究成为人们关注的热点。铜绿假单胞菌可通过外膜蛋白oprD2基因缺失而导致对亚胺培南等β内酰胺类抗生素耐药。oprD2是外膜蛋白中亚胺培南和β内酰胺类酶抑制剂进入菌体的特异性通道,如外膜蛋白缺失,药物难以到达其靶作用位点,从而使细菌产生耐药。本研究40株MDRPA菌株中oprD2基因缺失26株,缺失率为65%,同时携带多种耐药基因的比率较高,与文献报导有所差异。产生氨基糖苷类修饰酶是细菌对氨基糖苷类抗生素产生耐药的主要原因。按酶的功能可将氨基糖苷类修饰酶分成乙酰转移酶(aac)、磷酸转移酶(aph)和核苷转移酶(ant)。本研究ant3Ⅰ基因的阳性率为36.0%,其它氨基糖苷类修饰酶基因aac6Ⅱ、aac6Ⅰ、ant2Ⅰ基因阳性率分别为35.1%、26.2%,20.1%,同一菌株同时携带2种以上氨基糖苷类修饰基因的42.0%,可以看出本地区氨基糖苷类修饰酶基因对铜绿假单胞菌的耐药性起到重要作用。本研究发现有一株铜绿假单胞菌所检测基因全部阴性,但也表现出高度耐药性,提示可能存在其它耐药机制,有待于进一步研究。

整合子具有捕获、切除、重排耐药基因的能力,并且能在启动子的作用下使之转变为功能性基因的表达单位,是一种通过转座子或接合质粒将金属酶在内的多种耐药基因在细菌中水平传播。整合子在整合酶的催化下,通过整合酶识别耐药基因盒并整合到自身的染色体上,并使其表达,从而使细菌获得耐药性。据统计,目前已有超过130多种耐药基因盒可以整合在整合子上,可以编码临床上几乎所有抗生素的抗性基因[6]。在整合子介导的耐药机机制中,I类整合子起着非常重要的作用,本研究中共检出I类整合子菌株9株,阳性率22.5%,提示携带多种耐药基因盒的整合子存在也是细菌多药耐药的原因之一。

铜绿假单胞菌多药耐药在全世界范围内的传播将会成为全人类重大的健康安全隐患,应引起临床广泛关注。合理使用抗感染药物,采取有效措施控制耐药菌株的出现、及时切断多阶段重耐药菌株的水平传播,显得尤为重要。

[1]汪 复,朱德妹,胡付品,等.2009年中国CHINET细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志,2010(05):325.

[2]孙景勇,倪语星,汪 复,等.2007年中国CHINET铜绿假单胞菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志,2009(03):192.

[3]Barbier F,Wolff M.Multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa:towards a therapeutic dead end[J].Med Sci(Paris),2010,26(11):960.

[4]曹 彬,王 辉,朱元珏,等.多药耐药铜绿假单胞菌院内感染危险因素及预后因素分析[J].中华结核和呼吸杂志,2004,27(1):31.

[5]崔红利,陈东风.氨曲南的临床应用[J].现代医药卫生,2008(13):1983.

[6]Partridge SR,Tsafnat G,Coiera E,Iredell JR.Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons[J].FE MS Microbiol Rev,2009,33(4):757.