花生主要过敏原Ara h1的纯化

吴序栎，肖 杰，刘志刚,*，吕志平，刘骏杰

(1.华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510642；2.深圳大学过敏反应与免疫学研究所，广东 深圳 518060；3.深圳出入境检验检疫局，广东 深圳 518060)

花生主要过敏原Ara h1的纯化

吴序栎1,2，肖 杰2，刘志刚2,*，吕志平3，刘骏杰2

(1.华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510642；2.深圳大学过敏反应与免疫学研究所，广东 深圳 518060；3.深圳出入境检验检疫局，广东 深圳 518060)

采用硫酸铵沉淀及凝胶过滤层析方法，纯化花生主要过敏原蛋白Ara h1，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)结合免疫印迹实验(Western-Blotting)进行鉴定。结果表明：可纯化出纯度90%以上的Ara h1过敏原蛋白。

花生；Ara h1；蛋白；纯化；过敏

食物过敏是食品工业面临的重要安全问题之一，食品过敏反应主要是由IgE介导的I型变态反应，严重时可能产生过敏性休克，甚至危及生命[1]。花生是重要的食物过敏原之一，美国的食物过敏症90%以上由花生、坚果类、鱼类、甲壳类、乳类、小麦、大豆和蛋类引起[2]，欧洲的食物过敏症主要由牛奶、蛋、花生、坚果、鱼、甲壳类、大豆、芝麻和小麦引起[3]。我国一项临床研究表明，过敏性哮喘病人的过敏食物种类以油料类食物居首位，如花生、芝麻、黄豆等；高蛋白类动物食品占24.5%[4]。花生过敏原包括多种蛋白质组分，它们高度糖基化，分子质量介于0.7～100kD之间，分别属于不同的蛋白质家族，其中Ara h1(vicilin)被认为是主要的花生过敏原，90%的花生过敏患者对其过敏[5]。随着人们对食品安全认识的深入，花生过敏原的研究在我国也逐渐得到重视。食品过敏原蛋白的分离纯化是开展食品过敏原蛋白研究的前提。为深入研究花生过敏原和研制低致敏花生制品，必需首先获得高纯度的花生过敏原蛋白。本研究以花生为实验材料，采用脱脂、硫酸铵沉淀及凝胶过滤层析方法，纯化出花生主要过敏原蛋白Ara h1，并进行免疫活性鉴定，为开展Ara h1蛋白结构和功能研究，及探讨各种食品加工过程对其致敏性的影响提供实验材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血清与原料

本研究所用的血清来自于10个有花生过敏史的患者，所有患者血清都由海口市人民医院提供并储存于－80℃备用(血清IgE检测为2级以上)，花生为国产鲁花9号。

1.1.2 试剂与仪器

生物素标记羊抗人IgE抗体 美国KPL公司；链霉亲和素(HRP) 美国Vector公司；HiTrap protein A、HiTrap Desalting F F、DEAE-SepharoseF F硝酸纤维素膜 美国Amersham Pharmacia公司；其他常用试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

垂直板型电泳槽、model 1000/500转膜电泳槽、常压层析控制系统 美国 Bio-Rad公司；凝胶成像及分析系统 法国Vilber Lourmat公司；层析柱 美国GE公司。

1.2 方法

1.2.1 花生蛋白的粗提

取花生反复冻融后用研钵研磨，得花生粉末。用预冷丙酮和乙醚于4℃交替去脂，直到上清液澄清为止，用吸管尽量吸干丙酮和乙醚并在通风橱中风干。按每克样品7mL加入PBS缓冲液进行蛋白提取，4℃磁力搅拌24h。提完后用冷冻离心机在15000r/min，4℃条件下离心15min，上清液即为过敏原粗提液。取上清液用PBS缓冲液透析(透析带截流范围为6～8kD)1d，期间换液4次。透析完后，取50mL进行SDS-PAGE电泳，剩余的样品经分装后放入－80℃冰箱保存。

1.2.2 硫酸铵分级沉淀

取10mL花生蛋白粗提液，在粗提液中逐步加入固体硫酸铵，使其充分溶解，先使硫酸铵饱和度达到30%，12000r/min离心10min，沉淀用100μL 双蒸水溶解，4℃保存；在上清液中再加入硫酸铵使硫酸铵饱和度达到70%，12000r/min离心10min，沉淀用100μL双蒸水溶解，4℃保存；同样操作使硫酸铵饱和度达到100%。

1.2.3 凝胶过滤层析法提取过敏原Ara h l

在BIO-RAD常压层析控制系统下，先用Superdex 200凝胶过滤层析柱纯化样品，以Tris缓冲液充分平衡系统后将硫酸铵分级沉淀后的花生蛋白上样，收集各峰液进行SDS-PAGE电泳，将收集的蛋白再用Superdex 75凝胶过滤层析柱纯化，以Tris缓冲液充分平衡系统进样，收集各峰液进行SDS-PAGE电泳，并通过免疫印迹鉴定纯化后蛋白的免疫活性。

1.2.4 SDS-PAGE电泳分析

采用不连续体系SDS-PAGE电泳平板凝胶，浓缩胶质量分数为5%，分离胶质量分数为12%，恒流电泳后，经考马斯亮蓝R250染色、醋酸脱色。

1.2.5 免疫印迹法鉴定过敏原

取含200μg蛋白液进行SDS-PAGE电泳，电泳完取出SDS-PAGE凝胶，按凝胶的大小剪取NC膜，将胶和膜放入电转移缓冲液中平衡20min后，在350mA恒流条件下，于4℃冰箱中电转40min。NC膜用2% BSA封闭2h后，加入过敏病人的阳性混合血清(按1:10稀释)。摇床上摇2h后放入4℃冰箱过夜，将NC膜转入生物素标记羊抗人IgE抗体(按1:1000稀释)中摇2h。链霉亲和素(HRP)按1:500稀释后将NC膜放入其中摇2h。最后DAB显色，待条带清晰后即用水冲洗，终止显色反应。

2 结果与分析

2.1 花生粗提液蛋白的SDS-PAGE

图1 花生粗提液蛋白SDS-PAGE结果Fig.1 SDS-PAGE of total protein in crude extract from peanut

如图1所示，花生粗提液蛋白条带至少有10条，蛋白条带分子质量分别为：98、63、42、39、30、28、23、20、18、15kD，其中含量高的有6条，分子质量分别为：63、30、28、20、18、15kD，其中以63kD处最为富集，63kD以下蛋白多且分布均匀。

2.2 花生粗提液蛋白免疫印迹结果

选用临床对花生过敏患者的阳性混合血清为一抗进行免疫印迹(Western-Blotting)鉴定。结果显示(图2)，花生过敏条带主要有7条，分子质量分别为98、79、76、63、42、39、15kD。

图2 花生过敏原免疫印迹鉴定图Fig.2 Identification of peanut allergens by Western-Blotting analysis

2.3 硫酸铵分级沉淀

图3 硫酸铵分级沉淀花生蛋白SDS-PAGE结果Fig.3 SDS-PAGE of peanut protein after ammonium sulfate precipitation

通过硫酸铵分级沉淀，分别取30%、70%、100%硫酸铵沉淀的花生蛋白进行SDS-PAGE检测。结果显示(图3)，不同种类蛋白的沉淀区间不尽相同，随硫酸铵铵饱和度的增加，沉淀中63kD蛋白条带逐渐清晰，当硫酸铵饱和度为100%时，沉淀中63kD蛋白含量最高，同时其他杂蛋白条带也随之减少。

2.4 Superdex 200凝胶过滤层析柱纯化过敏原

通过100%硫酸铵沉淀的花生蛋白，经Superdex 200凝胶过滤层析，结果见图4。一共得到了5个峰，收集各峰后做SDS-PAGE检测。由图5可见，经SDS-PAGE鉴定，结果显示第1号峰的蛋白主要有1条带，分子质量为63kD，与Arah1蛋白分子质量大小相符，另外也有少量的杂蛋白条带；其余各峰均未出现63kD蛋白条带。收集第1号峰的蛋白，经Superdex 75凝胶过滤层析，结果见图6，得到1个峰，收集后做SDS-PAGE检测，图7结果显示，第1号峰的蛋白只有1条带。由电泳图像分析软件得到相关数据，以相对迁移率为纵坐标，标准蛋白分子质量对数为横坐标，绘制标准曲线，计算出的电泳条带对应分子质量为63kD，与已报道Arah1蛋白分子质量大小相符。同时经过密度扫描可知其纯度大于90%。

图4 Superdex 200凝胶过滤层析纯化峰型图Fig.4 Purification of protein by Superdex 200 size exclusion chromatography

图5 Superdex 200凝胶过滤层析各峰液的SDS-PAGE结果Fig.5 SDS-PAGE of purified peanut protein by Superdex 200 size exclusion chromatography

图6 Superdex 75凝胶过滤层析纯化峰型图Fig.6 Purification of total protein by Superdex 75 size exclusion chromatography

图7 Superdex 75凝胶过滤层析各峰液的SDS-PAGE结果Fig.7 SDS-PAGE of purified peanut protein by Superdex 75 size exclusion chromatography

2.5 纯化后免疫鉴定

取经Superdex 75凝胶层析后第1号峰液进行免疫印迹鉴定，结果见图8。第1号峰有1条阳性条带，分子质量为63kD，与预期的结果相符，通过免疫印迹证明纯化后蛋白具有免疫活性，且能分离出63kD的花生Ara h1蛋白。

图8 花生蛋白纯化后的蛋白免疫印迹图Fig.8 Western-Blotting analysis of purified peanut protein

3 讨 论

花生过敏同其他食物过敏一样属于速发型过敏，但是与其他食物过敏的不同处在于大部分花生过敏病人的这种疾患是终身的[6]。花生过敏有时可引起过敏性休克[7]，甚至危及生命[8-11]。作为在欧美能够引起食物过敏死亡率最高的花生在我国也应该引起高度重视。开展花生过敏研究，分离获得其主要过敏原作为研究材料是关键。

本研究利用蛋白质在分子质量上的差异性通过凝胶过滤的方法纯化花生过敏原。凝胶过滤又叫分子筛过滤，是利用凝胶粒子为固定相，根据料液中溶质相对分子质量的差异进行分离的液相层析法，它根据溶质颗粒的大小而决定溶质流程的长短，将不同大小分子质量的溶质分开，其原理是凝胶具有多孔网状结构，分子大小不同的物质在层析柱中受固定相的阻滞作用不同，大分子物质不能进入凝胶内部小孔，只能沿凝胶颗粒间的孔隙随洗脱液流动，故受到的阻滞作用小、流程短而较先流出柱外；而小分子物质可以进入凝胶颗粒内部，受到的阻滞作用大、流程长而较后流出层析柱，这样就使得样品中分子质量大小不同的物质得到分离[12-13]。Ara h 1占花生总蛋白的12%，是分子质量为63.5kD的糖蛋白[14]，等电点为4.55[15]，热稳定性强、耐酶解、不易消化[16]，同时通过对Ara hl的一级、三级、四级结构的研究表明Ara hl是作为一种三聚体复合物形式出现的[17]，是比较大的蛋白质，所以通过凝胶过滤层析的方法进行纯化分离是可行的，从凝胶过滤层析的实验结果可以发现，Ara h1蛋白做为第1个峰层析出来，可能是其作为一个三聚体复合物大分子的原因。本实验先用分辨率较低的Superdex200凝胶过滤柱层析后再用分辨率比较高的Superdex 75凝胶过滤柱层析，实验结果较好，基本能得到完全纯化的蛋白。

本实验在对Ara h1蛋白进行鉴定时，通过SDSPAGE电泳结合Western-blotting实验进行，纯化得到的蛋白分子质量为63kD左右，与文献报道结果一致，可以确定纯化蛋白即为Ara h1。如需进一步研究其生化特性，可对分离蛋白做等电聚焦及质谱分析等实验进一步完善。

[1] 咸军. 食品过敏原对食品安全性的影响[J]. 江苏调味副食品, 2001,70(3): 4-5.

[2] LEHRER S B, AYUSO R, REESE G. Current understanding of food allergens[J]. Ann N Y Acad Sci, 2002, 964: 69-85.

[3] BODEN M, DADSWELL R, HATTERSLEY S. Review of statutory and voluntary labelling of food allergens[J]. Proc Nutr Soc, 2005, 64(4):475-80.

[4] 胡光荣, 南晓方, 梅海豫, 等. 食物过敏性哮喘56例分析[J]. 临床军医杂志, 2005, 33(1): 49-50.

[5] POMS R E, KLEIN C L, ANKLAM E A. Methods for allergen analysis in food: a review[J]. Food Addit Contam, 2004, 21(1): 1-31.

[6] 刘建欣, 郑昌学. 现代免疫学: 免疫的细胞和分子基础[M]. 北京: 清华大学出版社, 2003: 78-94.

[7] 叶世泰. 我国常用食品致喘40例分析[J]. 临床荟萃, 1986(12): 12-13.

[8] DAVID M. The natural history of peanut and tree nut allergy[J]. Current Allergy and Asthma Reports, 2007, 7(3):175-181.

[9] BOYD C K. Fatal nut anaphylaxis in a 16-year-old male: case report[J].Allergy Proc, 1989, 10(4): 255-258.

[10] EVAN S, SKEA D, DOLOVITCH J. Fatal reaction to peanut antigen in almond icing[J]. Can Med Assoc, 1998, 139(3): 231-232.

[11] FRIES J H. Peanut: Allergic and other untoward reations[J]. Ann Allergy,1982, 48(4): 220-226.

[12] 赵永芳. 生物化学技术原理及其应用[M]. 武汉: 武汉大学出版社,1994: 113-119.

[13] 李建武, 肖能庚, 余瑞元, 等. 生物化学实验原理和方法[M]. 北京:北京大学出版社, 1994: 47-56.

[14] PARK C W, KIM G, HEOL LEE C. A comparison study on allergen components between Korean and American peanut[J]. Korean Med Sci,2000, 15(4): 387-392.

[15] BURKS A W. Identification of a major peanut allergen, Ara h I, in patients with atopic dermatitis and positive peanut challenges[J]. Allergy Clin Immunal, 1991, 88(2): 172-177.

[16] WIJK F, HARTGRING S, KOPPELMM S J. Mixed antiboby and T cell response to peanut and the peanut allergen Ara h1, Ara h2, Ara h3 and Ara h6 in oral sensitization model[J]. Clin Exp Allergy, 2004, 39(4):1422-1428.

[17] BURKS A W, WESLEY A, HELM R M. Major peanut allergen ArahⅡ[J]. Biotechology Advances, 1997, 15(2): 445.

Purification of Peanut Allergen Ara h1

WU Xu-li1,2，XIAO Jie2，LIU Zhi-gang2,*，Zhi-ping3，LIU Jun-jie2
(1. College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510642, China；2. Allergy and Immunology Institute, Shenzhen University, Shenzhen 518060, China；3. Shenzhen Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518060, China)

In order to obtain the peanut allergen Ara h1, ammonium sulfate precipitation and size exclusion chromatography were used for the purification. The identification of peanut allergens was carried out using SDS-PAGE and Western blot analysis.The results indicated that peanut allergen Ara h1 was isolated with purity of more than 90%.

peanut；Ara h1；protein；purification；allergy

TS201.6；R392.8

A

1002-6630(2011)05-0012-04

2010-05-12

国家自然科学基金项目(30871752)；广东省科技重点专项(2003A3080502)

吴序栎(1977—)，男，讲师，博士研究生，研究方向为食品安全与食品过敏。E-mail：wxl@szu.edu.cn

*通信作者：刘志刚(1957—)，男，教授，博士，研究方向为过敏反应。E-mail：lzg@szu.edu.cn