中国金顶侧耳菌株遗传多态性的ISSR分析

张秋胜，徐丙莲，刘林德，程显好，高兴喜，史亚丽

(1.鲁东大学生命科学学院，山东 烟台 264025； 2.鲁东大学数学与信息学院，山东 烟台 264025；3.鲁东大学体育学院，山东 烟台 264025)

中国金顶侧耳菌株遗传多态性的ISSR分析

张秋胜1，徐丙莲2，刘林德1，程显好1，高兴喜1，史亚丽3

(1.鲁东大学生命科学学院，山东 烟台 264025； 2.鲁东大学数学与信息学院，山东 烟台 264025；3.鲁东大学体育学院，山东 烟台 264025)

金顶侧耳是重要的食药用真菌。本实验收集全国各地18种金顶侧耳菌株，通过ISSR分子标记技术分析金顶侧耳菌株种内遗传多态性，11种引物扩增出102个条带，其中78个条带具有多态性，多态率为76.4%。结果表明，金顶侧耳菌株内具有丰富的遗传多样性，遗传相似系数在0.50～0.96。采用平均分类法UPGMA分析表明，在遗传相似系数为0.62时，18种菌株分为两大类。当遗传相似系数增大到0.75时，它们分为7类。16号菌株具有独立的遗传体系。

金顶侧耳；简短重复序列；多态性；亲缘关系

金顶侧耳(Pleurotus cituinopileatus)子实体颜色浅黄或金黄，所以也叫榆黄菇，是著名的食药用真菌[1-2]。近年来，中国金顶侧耳的遗传规律、栽培技术等已取得了一定进展，但其种质资源概况和遗传基础仍缺乏系统的研究，以致中国金顶侧耳育种对种质资源的利用存在较大的盲目性、重复性，影响了育种效率的提高[3-5]。ISSR(inter-simple sequence repeats)分子标记是基于真核生物基因组中广泛分布的微卫星重复序列具有较高的重复性和稳定性的特点，目前已广泛用于遗传多样性、品种鉴定、系统进化等研究中[6-9]。

本实验从国内多家菌种单位收集不同品种的金顶侧耳种质材料，应用ISSR分子标记对中国有代表性的18种金顶侧耳种质材料进行遗传多态性分析，旨在为金顶侧耳的菌株鉴定、育种的亲本选择提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株材料

收集全国各地的金顶侧耳菌株，接种到PDA固体培养基中，25℃培养5～7d直到菌丝体生长良好，用作本实验菌种。18种菌株分别编号为1～18。各实验菌株来源如表1。

表1 金顶侧耳供试菌株Table 1 Pleurotus cituinopileatus strains tested in this study

1.2 试剂与培养基

葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、VB1、琼脂粉均为国产分析纯 上海国药集团；Premix Taq version 2.0大连宝生物工程有限公司。

PDA平板培养基：马铃薯(去皮)200g、葡萄糖20g、蛋白胨2g、KH2PO43g、MgSO41.5g、VB120mg、琼脂17g、水1000mL，pH值自然。

1.3 仪器与设备

GIS-2020D 全自动数码凝胶成像分析系统 宁波新芝生物科技股份有限公司；LRH-250型生化培养箱、YXQLS-60SⅡ型全自动数显高压蒸汽灭菌器 上海精密仪器仪表有限公司；PT-200型PCR扩增仪 美国PE公司。

1.4 菌株基因组总DNA抽提

经活化的菌株在PDA液体培养基中25℃培养7d，从培养基中收集菌丝球。采用CTAB法提取基因组DNA[10]。

1.5 引物

表2 实验引物及其序列Table 2 Primers used in this study and their sequences

随机引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，从30条随机引物中剔除无扩增引物和带纹模糊难于分辨的引物，利用扩增条带清晰、稳定、特异性强的11条引物扩增不同株系的DNA样本，以检测引物在群体中的多态性。

1.6 ISSR分析的PCR反应体系和程序

PCR反应体系：Taq酶0.5U，Mg2＋2.5mmo1/L，dNTP 0.2mmo1/L，Primer 0.75μmo1/L，模板DNA 50ng。

PCR扩增程序为：94℃变性4min；94℃变性45s，50～52℃退火45s，72℃延伸90s，循环35次；72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物用1.6%琼脂糖凝胶，在不超过5V/cm的电压下电泳，电极缓冲液为1×Tris-乙酸(TAE)，用0.5g/mL嗅化乙锭(EB)染色30min，凝胶成像系统拍照记录。

1.7 数据统计与分析

从初选后的各组中，随机抽取1份材料作为代表，参加不同基因型间多态性分析。统计各基因型间表现多态性好的引物的扩增位点。在条带图上，以“0”和“1”的方式记录电泳结果图版中条带位置，有条带赋值“l”，无条带赋值“0”，作0/1矩阵输入计算机，采用生物学统计软件NTSYSPc2.10e进行分析。运用指数法，计算菌株间遗传相似系数(GS)。依据遗传距离，采用UPGMA聚类分析构建分子系统进化树。

2 结果与分析

2.1 金顶侧耳菌株ISSR结果分析

从30条ISSR随机引物中共筛选出扩增条带清晰、稳定的11条较为理想的随机引物，分别为引物826、835、834、P3、P7、P8、P12、827、812、IS5、825。由扩增的DNA指纹图谱(图1、2)可以看出，每个引物对不同菌株扩增的DNA条带数不等，一般在5～14个之间，绝大多数扩增片段大小在200～2200bp之间。同时，有的引物扩增出的几个产物片段为所有菌株所共有，即说明这些引物与金顶侧耳菌株DNA结合位点比较保守，该区域即为金顶侧耳菌株物种特征遗传信息。

图1 引物835对18种金顶侧耳菌株基因组ISSR指纹图谱Fig.1 PCR identification of Pleurotus cituinopileatus with primer 835

图2 引物P3对18种榆黄菇基因组ISSR指纹图谱Fig.2 PCR identification of Pleurotus cituinopileatus with primer P3

2.2 供试菌株的ISSR多态性位点统计

表3 供试菌株的ISSR多态性位点统计结果Table 3 Polymorphic loci amplified by ISSR of tested strains

由表3可见，不同引物的多态性位点频率不同。引物P3的多态性位点频率为55.6%，而引物812和826的多态性位点频率则达87.5%，平均多态性为76.4%。另外，在11个随机引物扩增得到的总共102个ISSR位点中，有78个位点具有多态性，其多态性位点频率为76.4%，说明金顶侧耳菌株种内具有丰富的遗传多样性。2.3 金顶侧耳菌株间亲缘关系分析

供试的18种金顶侧耳菌株两两之间的遗传相似系数为0.50～0.96。其中，菌株2与3号、菌株3与5号间相似系数最大(0.96)，菌株8与17号间相似系数最小(0.50)。表4是利用NTSYC-pc 2.10e 软件分析得出的菌株间相似系数。

根据ISSR数据统计遗传距离值，按UPGMA法进行聚类分析，建立系统亲缘关系图，结果见图3。

图3 18种金顶侧耳菌株的亲缘关系聚类图Fig.3 Genetic relationship dendrogram of 18 Pleurotus cituinopileatus strains

从图3可知，相似系数为0.62时，金顶侧耳菌株主要分为两大类。6、7号和16号菌株组成一类，其余的为一大类，在这一大类中，又可分成三类。当相似系数增大到0.75时，它们又可分为七类。3、5号菌株之间亲缘关系较近，相似系数为0.96，而1、6、8号菌株与16号菌株的亲缘关系较远，相似系数只有0.54，说明我国金顶侧耳菌株资源遗传多态性丰富。从菌株的来源看，来自盘锦新北方食用菌研究所菌种保藏中心的菌株16号和其他的各种金顶侧耳亲缘关系较远，却和来自江苏省高邮市科学院的菌株9、10号亲缘关系更近些，这可能与我国不同单位之间频繁引种有关。相同或相近地区来源的菌株基本可以归在一起，这可能与金顶侧耳实际地理分布相关，如菌株14和15号；菌株4和11号均归为一类；同时，从菌株组成看，来自中国北方的占多数。来源相同的菌株，其遗传结构也不同，如菌株1和2号，这可能与其各自的繁育系统等因素有关。

表4 18种金顶侧耳菌株间相似系数Table 4 Similarity coefficients among 18 Pleurotus cituinopileatus strains

3 讨论与结论

传统形态学分类是以子实体形态、菌盖颜色、孢子的形状及菌柄的有无等特征为分类依据。但其形态学特征易受到环境因子的影响变得不易区分[11]。分子标记，尤其是遗传物质DNA具有较高的稳定性[12]。简单重复间序列(ISSR)标记具有较强的专一性、重复性和可操作性。该标记技术在灵芝、香菇等其他食用菌中已有应用，但在金顶侧耳中则未见报道[13-14]。

利用ISSR技术在分子水平上对我国不同来源地的金顶侧耳菌株遗传多样性进行了分析，结果表明，中国栽培金顶侧耳菌株的多态性较为丰富，可以利用和开发的菌种资源较多。从收集菌株来源来看，北方地区总的菌株数量要大于南方地区的菌株数量，这可能与金顶侧耳的主要栽培地区在中国北方相关。金顶侧耳经多年栽培，许多品种已发生了较大变异，这也可能与金顶侧耳易发生变异相关[15]。总的来说，金顶侧耳菌株资源在我国是很丰富的，尤其是在中国北方地区。从聚类的结果看，地域性较强，大部分来自同一地区的栽培菌株往往能够聚为一类，也有一些栽培菌株和其他地区栽培菌株聚为一类，可能与我国金顶侧耳栽培菌株引种频繁、穿插引种等现象密切相关。这种现象在别的食用菌中也存在[16-17]。由于本研究选用了生产中常用18个菌株，该结果对金顶侧耳系统学研究可提供一些参考。

亲缘关系比较接近的种可能具有相同的遗传背景，因此通过对这些菌株间亲缘关系的了解，进而可利用系统进化理论做出更为合理的分类和命名，还有利于筛选出适合杂交的品种，可以更有效地对金顶侧耳进行遗传育种和菌株保藏。本实验中菌株16号离遗传中心较远，其远缘优势应在育种选育中应引起重视。

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Genetic Polymorphism Analysis of Pleurotus cituinopileatus by ISSR

ZHANG Qiu-sheng1，XU Bing-lian2，LIU Lin-de1，CHENG Xian-hao1，GAO Xing-xi1，SHI Ya-li3
(1. School of Life Science, Ludong University, Yantai 264025, China；2. School of Mathmatics and Information, Ludong University, Yantai 264025, China；3. Sports Institute, Ludong University, Yantai 264025, China)

Pleurotus cituinopileatus is an important kind of edible medicinal fungi. Totally 18 kinds of Pleurotus cituinopileatus strains were collected from some markets in China. Inter-simple sequence repeat (ISSR) method was used to analyze genetic polymorphism of Pleurotus cituinopileatus strains. A total of 102 DNA fragments were amplified by using eleven ISSR primers,and 78 of these fragments were polymorphic with polymorphism rate of 76.4%. Meanwhile, high-level genetic polymorphism was observed in Pleurotus cituinopileatus and the genetic similarity coefficients (GSC) were between 0.50 and 0.96. These 18 strains were divided into 2 groups at GSC of 0.62 and 7 groups at GSC of 0.75 according to the cluster analysis of UPGMA method. Strain 16 had an independent genetic system. These results will provide a scientific fundament to accelerate genetic breeding and identification of cultivated strains of Pleurotus cituinopileatus.

Pleurotus cituinopileatus；inter-simple sequence repeat (ISSR)；polymorphism；intra-specific relationship

S646

A

1002-6630(2011)05-0172-04

2010-05-16

“十一五”国家科技支撑计划项目(2008BADA1B04)；鲁东大学人才基金项目(LY20063303)；

鲁东大学创新团队建设项目；鲁东大学学科建设经费项目

张秋胜(1974—)，男，讲师，博士，研究方向为菌物遗传学。E-mail：qiushengzhang@126.com