芦笋18S rDNA序列和分类分析

侯进慧，蔡 侃，郑宝刚，曹玉朋，王清泉

(徐州工程学院食品(生物)工程学院，江苏 徐州 221008)

芦笋18S rDNA序列和分类分析

侯进慧，蔡 侃，郑宝刚，曹玉朋，王清泉

(徐州工程学院食品(生物)工程学院，江苏 徐州 221008)

通过植物基因组提取方法对芦笋的基因组DNA进行提取，采用PCR方法对其18S rDNA片段进行扩增，再经连接、转化、筛选后，获得长度为1684bp的 18S rDNA序列。将序列提交后，获得GenBank数据库基因登录号GU217543。分析芦笋18S rDNA的基因序列，确定芦笋与百合目(Liliales)和天门冬目(Asparagales)的多种植物在分类上有很近的关系，从而对分子水平上芦笋的分类有了进一步的了解。

芦笋；18S rDNA；分类

芦笋(Asparagus officinalis L.)又名石刁柏、龙须菜、笋尖、文山竹、露笋，其嫩茎质地细腻，纤维柔软、风味鲜美、能增进食欲、帮助消化，是世界公认的十大健康蔬菜之首。其资源丰富、价廉物美，且具有很好的药理作用以及很高的营养价值。在最早的药书《神农本草经》中将其列为“上品之上”，称其久服轻身、益气延年。有研究表明，其具有很好的抗突变、抗癌作用，能改善人体免疫功能，尤其对T细胞免疫水平起保护作用[1-3]。分析芦笋分类地位和资源状况，有利于深入了解其功能特性，推进这种食品资源的开发。目前对芦笋的遗传基础研究较少，尚未见针对其核糖体DNA(rDNA)的研究。rDNA是编码核糖体RNA的基因，通过测定其序列可以鉴定物种同源性，确定其分类地位，掌握物种多样性。目前，rDNA序列分析技术已广泛应用于植物分类、系统发育以及中药材的鉴定中。比如，利用植物中药材rRNA基因内转录间隔区引物DNA进行扩增，同时对扩增产物DNA碱基排序测定，可作为中药材分子鉴定的标记[4]。本实验通过测序获得芦笋18S rDNA序列，对芦笋的分类进行初步分析，为芦笋资源分类研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

以产自江苏丰县的芦笋(Asparagus officinalis L.)作为实验材料。

PCR反应引物合成试剂 上海生工生物工程技术服务有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、T-载体、T4 DNA 连接酶、植物基因组提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 芦笋基因组DNA的提取

使用无菌刀片将去皮并经ddH2O清洗过的芦笋切成条状，以液氮研磨成粉末状，采用植物基因组提取试剂盒提取芦笋基因组DNA，使用琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，作为 PCR反应模板。

1.3 芦笋18S rDNA序列克隆测序

用于扩增18S rDNA 序列的引物为[5-6]：F：5′-GTA GTCATATGCTTGTCTC-3′和 R：5′-TCCGCAG GTTCACCTACGGA-3′。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性60s，56℃退火60s，72℃延伸2min，反应25个循环；72℃延伸10min。用DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，将18S rDNA序列与T-载体连接，转化大肠杆菌后送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.4 芦笋的分类分析

将芦笋18S rDNA序列提交NCBI网站，获得登录号。使用BLAST程序在GeneBank中进行序列比对，获得与芦笋序列相近物种的18S rDNA序列，利用DNAMAN程序进行分析。通过碱基序列比对和相似度分析构建系统发育树，获得芦笋与相关物种的分类关系[7-8]。

2 结果与分析

2.1 芦笋18S rDNA的扩增结果

将提取的基因组DNA 与扩增出的18S rDNA进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示，所提取DNA的质量合格，PCR方法获得的18S rDNA无杂带，特异性强，可以进行克隆、测序(图1A)。使用限制性内切酶PstI将18S rDNA与T-载体pUCm-T(2773bp)的重组质粒进行切割后可见18S rDNA插入序列(图1B)，筛选出阳性克隆。

图1 芦笋18S rDNA克隆的电泳结果Fig.1 Electrophoresis results of amplification products Asparagus officinalis L. 18S rDNA

2.2 芦笋18S rDNA序列

将克隆的芦笋18S rDNA序列送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序分析，通过双向测序，利用软件进行序列拼接，最终获得了芦笋的长度为1684bp的 18S rDNA序列(图2)。将该序列登录到GenBank数据库中，获得基因登录号：GU217543。

图2 芦笋18S rDNA序列Fig.2 Sequence of Asparagus officinalis L. 18S rDNA

2.3 芦笋分类学分析

在GenBank数据库中搜索基因数据信息，获得了与芦笋18S rDNA序列相近的19个物种的18S rDNA序列，利用DNAMAN程序，对相关物种的18S rDNA序列进行分析。通过构建系统发育树(图3)，获得芦笋与相关物种的分类关系。序列分析显示，芦笋与百合目(Liliales)的百合科(Liliaceae)和天门冬目(Asparagales)的多种植物序列聚类在一起，它们在分类上有很近的关系。

图3 根据芦笋的18S rDNA序列和GenBank相关序列构建的系统发育树Fig.3 Neighbor-joining tree based on 18S rDNA sequence of Asparagus officinalis L. and its close relatives in GenBank

3 讨 论

在传统的农作物资源分析和系统分类学的研究中，一般通过形态解剖学、孢粉学和生理生化等特征进行表型分析，并基于表型分析结果进行物种资源分类，其方法有一定的局限性，而采用分析作物DNA中的分子信息，不仅信息量大，可以提高农作物系统分类在分子水平上的直接证据，而且可以从分子水平上认识物种分化的内在原因和物质基础[9-10]。因此，利用诸如rDNA等一些分子序列进行农作物资源分析，是当今农业资源分析研究的一个热点和趋势[11]。本实验通过测序获得了芦笋18S rDNA的基因序列。序列分析结果显示，芦笋与百合目(Liliales)的百合科(Liliaceae)和天门冬目(Asparagales)的多种植物在分类上有很近的关系。人们利用传统分类学方法，对芦笋的分类是：被子植物门(Magnoliophyta)，单子叶植物纲(Liliopsida)，百合目(Liliales)，百合科(Liliaceae)，天门冬属(Asparagus Linn.)，芦笋(Asparagus officinalis L.)。

本实验利用18S rDNA基因序列分析芦笋的分类学地位，与传统分类学的结果是相近的。同时，本实验结果也显示出，芦笋与天门冬目的亲密关系。通过图3 可以看出，系统发育树中18个物种都是天门冬目的，而百合目的只有一个物种Luzuriaga latifolia(AF233091)。这说明百合目和天门冬目在分类学上的关系很密切，通过18S rDNA基因序列分析很难将这两个目的物种截然分开，这还需要增加一些基因序列的分析，才能对芦笋的分类地位进行精确的分子分析。

[1] 汤新慧, 高静. 芦笋汁的抗突变作用[J]. 南京大学学报: 自然科学版,2001, 37(5): 569-573.

[2] 凌莉, 李志勇. 果蔬中的功能因子[J]. 食品科学, 2006, 27(12): 906-909.

[3] 郭兵, 张春林, 孟金玲, 等. 芦笋对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响[J].贵阳医学院学报, 1995, 20(4): 285-287.

[4] 李萍, 蔡朝晖, 邢俊波. 5S rRNA基因间序列变异用于金银花药材道地性研究初探[J]. 中草药, 2001: 32(9): 834-836.

[5] 吴耀生, SLOCOMBE S. 中药三七根核糖体18S rRNA基因的序列分析[J]. 中草药, 2001, 32(12): 11-16.

[6] 杨泽民, 章群, 谢数涛, 等. 鞭金藻18S rRNA基因序列分析与分类学意义[J]. 水利渔业, 2008, 28(2): 13-15.

[7] 侯进慧, 刘全德, 高明侠, 等. 胡萝卜表面产纤维素酶细菌初步鉴定分析[J]. 食品科学, 2010, 31(5): 233-236.

[8] 侯进慧. 牛蒡表面产纤维素酶细菌的分离鉴定[J]. 食品工业科技,2010, 31(2): 181-182; 207.

[9] SCHAAL B A, LEARN G H, Jr. Ribosomal DNA variation within and among plant population[J]. Ann Missouri Bot Gard, 1988, 75(10):1207-1216.

[10] APPLE R, DVORAK J. The wheat ribosomal DNA spacer region: ITS structure and varuation in population and among species[J]. Theor Appl Genet,1982, 63(4): 337-348.

[11] 刘志文, 韩旭, 赵明辉, 等. 核核糖体DNA在植物系统发育中的应用与研究进展[J]. 安徽农业科学, 2008, 36(9): 3561-3562.

Sequence and Classification Analysis of 18S rDNA in Asparagus officinalis L.

HOU Jin-hui，CAI Kan，ZHENG Bao-gang，CAO Yu-peng，WANG Qing-quan
(College of Food (Biological) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

In this study, the genomic DNA of Asparagus officinalis L. was extracted by plant genome extraction method, and its fragment of 18S rDNA was amplified by PCR method, followed by ligation, transformation, and screening. An 18S rDNA fragment of 1684 bp in length was sequenced. The accession number of the sequence in Genbank was GU217543. The gene sequence of Asparagus officinalis L. was analyzed. The results indicated that Asparagus officinalis L. had close genetic relationship with the species of Liliales and Asparagales. Based on these investigations, the classification of Asparagus officinalis L. has been further understood at the molecular level.

Asparagus officinalis L.；18S rDNA；classification

S59.023

A

1002-6630(2011)05-0221-03

2010-05-27

徐州市科技计划项目(XZZD0924)；徐州工程学院引进人才科研启动项目；徐州工程学院科研项目(XKY2008110)；

江苏省大学生实践创新计划项目(2010-971)

侯进慧(1980—)，男，讲师，博士，研究方向为生物工程。E-mail：houjinhui0@126.com