序贯法测定原位凝胶材料OALA的LD50

顾 娜，李 旭，邓联东，梁艳琴，王伟伟，胡人杰

（1.天津医科大学研究生院，天津300070；2.天津市医药科学研究所，天津300020；3.天津大学化学工程技术学院，天津300073）

原位凝胶是一种新型的具有控释作用的药物制剂材料[1]。与传统的给药系统相比，原位凝胶有着显著的优点。OALA属于聚酸酐类原位凝胶材料，系由天津大学化学工程技术学院研发的一种可生物降解高分子材料，由于其具有良好的表面溶蚀降解性[3]、生物相容性、结构易改性、降解速率可调及易加工性等优异性能，有望成为新型药用辅料而在医学前沿领域得到应用。本项研究通过OALA血管内给药对其使用安全性进行评价，为其深入的生物学及药学实验研究设计提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 受试药 原位凝胶材料OALA：为白色片状粉末，由天津大学化学工程技术学院提供。

1.1.2 实验动物 KM种小鼠，Ⅱ级实验动物，北京大学医学科学院实验动物研究中心提供，合格证号：sxck(京)2006-0008。标准化Ⅱ级动物实验室，IVC屏障系统，使用许可证号：SYXK（津）2005-0001。普通全价颗粒饲料Ⅱ号，由北京科澳协力饲料有限公司生产，京动许字（2000）第015号，动物饮用纯净水。

1.2 实验方法

1.2.1 给药剂量设计 采用序贯法[2-5]等体积给药（即给药体积相等，通过改变溶液药物浓度调整给药剂量）和等浓度给药（即给药溶液浓度不变，通过改变给药体积调整给药剂量）给药方案。经预实验确定动物存活率为100%与0的剂量，剂量间距设计为 1∶0.87。前者设计给药浓度为 10、8.7、7.6、6.6、5.7、5mg/mL（给药体积为0.4mL/20 g体重），后者设计给药体积为 0.64、0.51、0.40、0.32、0.25、0.20mL（设计浓度为7.53mg/mL）。

1.2.2 实验数据的采集 按从高剂量至低剂量的顺序进行静脉注射，注射后观察10min，若动物出现死亡则降低一剂量组给药，若动物存活则提高一剂量组给药，直至按照要求实验过程中出现5~6个“不死波谷”的周期剂量；对实验存活动物描述其相关活动；对死亡动物进行常规病理解剖，摘取心脏、肺脏、肝脏、肾脏及脑组织，10%福尔马林固定，石蜡包埋，组织病理切片，HE染色，光学显微镜观察。

1.2.3 LD50的计算 按照下述公式∶

X0为实验第一次出现阳性（即存活）为中心组的剂量值，N为各实验组出现阳性数的总和，A为各组阳性数与组序之积再求和，B为各组阳性数与组序平方之积再求和，i为剂量对数的公差项

2 结果

2.1 实验动物反应情况 致死剂量OALA注射后动物会即刻出现死亡，死亡均出现于给药后1min之内，死亡前动物偶见排便现象。注射存活剂量后，动物出现竖毛、卧伏不动、身体倾斜、眼闭，严重者出现抽搐、跳跃等现象，4 h后恢复常态，继续观察1周，动物未见异常。

实验操作依据：剂量对数值之差（i）以4~6组可包括0%和100%死亡率为宜，第一次变号的前一次作为实验开始。具体实验结果详见图1和图2。

图1根据计算公式，LD50=7.53mg/mL（给药体积为 0.4mL/20 g体重）；Sm=0.017；95%可信限为7.53±0.576。

图2根据计算公式，LD50=0.31mL（给药浓度为7.53mg/mL）；Sm=0.081；95%可信限为 0.31±0.113。

最终计算两种给药方法小鼠静脉注射给药的LD50分别为150.6mg/kg和116.7mg/kg。

2.2 组织病理学观察 病理组织观察结果显示，小鼠肺组织各级静脉扩张瘀血，血管腔可见蓝灰色细颗粒状材料，见图3，其它组织器官未见病理组织学改变。通过动物死亡时的表现以及组织病理学的观察可以认为动物的死亡原因系由于急性、弥漫性肺栓塞所致。

3 讨论

LD50的测定系评价生物样品安全性的重要技术指标，其测定方法主要包括Bliss机率单位法、简化机率单位法、寇氏法、目测图示法、综合计算法[2-5]等。与上述方法相比较，本实验所采取的序贯法特别适用于可迅速致死的样品的测定且简便易行，节省动物。预实验结果发现测试样品OALA静脉注射可致动物迅速死亡，故而在实验中采用本方法。

实验样品OALA是一种新型的、用作药物载体的温敏型纳米凝胶材料，该材料在体内、外具有条件成胶的特性，即在一定的浓度（25%，W/W）下，一定的温度范围（体温）内形成凝胶。体内成胶后OALA将在体液对其不断的溶蚀作用下将其所载药物释出，从而达到控释、缓释作用。以往笔者所测定的OALA成胶条件均是由体外（试管内）及动物皮下植入所获得的，血管内途径测试该样品为首次。由实验结果可以看出，尽管测定LD50时笔者给入的样品配制的浓度（1%）远远低于体外（体内动物皮下）成胶的浓度，但是在小血管和微循环中OALA作为“凝胶的性质”仍然保留，即便浓度很低仍可成胶。这一现象是否提示体内成胶浓度可低于体外成胶浓度，有待进一步证实。

另外，由于OALA成胶与浓度具有明确的关系，即浓度越低越不容易成胶，在血管内也是如此，本实验结果也证明了这一点，当浓度（给入剂量）低到一定程度将不会造成动物死亡，笔者曾经尝试不改变（致死）剂量而将给药体积增加一倍，则可使“毒性”大幅度降低，这一结果也说明了纳米凝胶体系与生物体相互作用的复杂性，而这种复杂性是由这种新型制剂的特性所决定，也正是考虑到这种复杂性笔者在实验中设计了等体积给药方案和等浓度给药方案。由此可见，如果想要综合评价OALA（或其它凝胶体系）血管内给药的安全性，则还应该设计更多的实验，更多、更全面地考虑凝胶特性与生物体的复杂性，才能得到更加可靠的，更加接近实际结论。

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