细胞因子诱导K562/MDR1分化为具有多药耐药特征的树突状细胞的实验研究

盛立霞，谢晓宝，欧阳桂芳，王 怡，朱慧玲，黄 河

(1.浙江大学医学院附属第一医院骨髓移植中心，浙江杭州310003;2.宁波市第一医院血液科，浙江宁波315010;3.苏州大学附属第三医院血液科，江苏常州213003)

多药耐药基因1(multidrug resistance gene1，MDR1)及其编码的膜表面P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)高表达是介导白血病细胞对常规化疗耐药的重要机制之一，传统化疗后残留的耐药细胞往往是白血病复发的根源。在动物实验及初步临床结果中，基于树突状细胞(dendritic cell，DC)的免疫治疗能清除微小残留病灶，为预防白血病复发提供了新的治疗策略［1］。在我们的前期工作中已经证实，耐药细胞所表达的Pgp能够作为免疫识别的靶抗原，通过负载DC诱导Pgp特异性的免疫应答，从而杀伤残留的耐药白血病细胞［2］。转染MDR1基因无疑是一种有效负载Pgp抗原的方案，但是，将MDR1基因转染DC前体细胞是否影响DC的诱导分化效率，高表达Pgp是否影响DC的抗原递呈功能，分化的DC能否获得多药耐药特征?这些问题都迫切需要进一步的研究。为此，本研究采用细胞因子组合，分别诱导转染MDR1基因的耐药K562细胞株及亲本K562细胞株分化为树突状细胞，探讨MDR1基因转染DC前体细胞对诱导分化后DC的表型及功能的影响。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 RPMI 1640、胎牛血清(FBS)为 GIBCO 公司生产;rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α购自Peprotech公司;MTT为Sigma公司产品;FITC或PE标记鼠抗人 CD1α、CD83、CD80、CD86、HLA-ABC、HLA-DR 和 Pgp 等单抗及同型对照购自 BD公司，流式细胞仪为FACScabilur型，BD公司生产。

1.2 细胞株与培养条件 K562和K562/MDR1细胞株由江苏省血液病研究所陈子兴教授惠赠。其中，K562/MDR1细胞是由逆转录病毒转导法将外源MDR1基因转入K562细胞，并经过长春新碱(VCR)筛选获得的多药耐药细胞株，传20代后仍稳定高表达Pgp糖蛋白，具有经典MDR1表型及多药耐药特征［3］。K562和K562/MDR1细胞常规培养于含10%FBS的RPMI1640中。本实验均采用对数生长期细胞。

1.3 K562和K562/MDR1来源DC诱导培养

取对数生长期的K562和K562/MDR1细胞，用含10%FBS的RPMI 1640培养液调整细胞浓度为5×105/ml，并接种于24孔培养板中，每孔 1 ml，加入 rhGM-CSF(1 000 IU/ml)、rhIL-4(800 IU/ml)，37℃、5%CO2培养箱培养，隔日半量换液并补上述细胞因子;培养至第10天加入 rhTNF-α(100 IU/ml)，共培养14 d。在培养过程中动态观察细胞形态及进行细胞计数。

1.4 流式细胞仪检测DC的表型以及Pgp表达 收集培养14 d的细胞，采用直接免疫荧光染色法，加入PE或FITC标记的鼠抗人CD1α、CD83、CD14、CD80、CD86、HLA-ABC、HLA-DR以及Pgp等单抗或同型阴性对照鼠IgG1孵育30 min，PBS洗涤2遍后加入PBS 400 μl上机，采用FACScabilur型流式细胞仪CELLQUEST软件检测分析。

1.5 混合淋巴细胞反应(allo-MLR) 取健康供者外周血10 ml，肝素抗凝，采用Ficoll密度梯度离心法获得PBMC，将PBMC用10%FBSRPMI1640培养基调整为2×106/ml接种于24孔板中，37℃、5%CO2培养箱孵育 2 h，收集非黏附细胞作为反应细胞(R);培养14 d的K562-DC、K562/MDR1-DC 用 25 μg/ml丝裂霉素处理30 min去增殖作为刺激细胞(S)。将S∶R 分别按1∶5、1∶10、1∶20 加入 96 孔板，各 200 μl/孔，每组3个复孔;另设刺激细胞、反应细胞对照孔，37℃、5%CO2培养箱孵育96 h。采用MTT比色法测570 nm波长处的吸光度(A值)，刺激指数(SI)=(A实验孔-A刺激细胞孔)/A反应细胞孔。

1.6 MTT方法测定药物IC50值 收集对数生长期的 K562、K562/MDR1以及培养14 d的K562-DC、K562/MDR1-DC细胞，调整细胞浓度至5×105/ml，在96孔板的各孔中加入100 μl细胞和不同质量浓度药物:阿霉素(ADM)0～100.0 μg/ml或者长春新碱(VCR)0 ～100.0 μg/ml，各浓度设3个平行孔，设对照孔和空白孔，常规培养48 h，采用MTT比色法测570 nm波长处的 A值。生长抑制率(%)=A实验组/A对照组×100%，计算出细胞生长抑制率50%的药物浓度即IC50，耐药倍数=耐药细胞IC50/敏感细胞IC50。

1.7 细胞内柔红霉素(DNR)蓄积量的测定将上述4种细胞按1×106/ml的质量浓度与1 μg/ml的 DNR 37℃共同孵育2 h后，冰浴终止。参照文献［4］方法用流式细胞仪检测细胞内DNR的蓄积量，以未经处理的K562/MDR1细胞为空白对照。

1.8 统计学处理 统计分析均由SPSS 13.0 for Windows统计软件完成，统计方法采用SPSS中一般线性模型进行双因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 K562/MDR1-DC的形态及表型特征K562及K562-MDR1细胞在含GM-CSF+IL-4的培养体系诱导下，3～4 d后体积逐步增大，形态由圆形转为不规则，7 d后不规则细胞增多，体积进一步变大，部分细胞可见树突状突起，加入TNF-α继续培养至14 d时，细胞树状突起明显，数量也进一步增多，具有典型的DC形态特征。

K562/MDR1-DC和K562-DC细胞的CDla、CD83、CD80、CD86、HLA-DR 在细胞因子的作用下，表达较诱导前均有明显的上调。经双因素方差分析显示，诱导分化过程对DC相关表型的上调具有统计学意义(P＜0.01);而转染MDR1基因对DC表型无显著影响(P＞0.05)，两者之间无交互效应(P＞0.05)，K562/MDR1-DC细胞和K562-DC细胞之间的各DC相关表型的表达差异均无统计学意义(P＞0.05)，这表明转染MDR1基因并不影响K562细胞诱生DC的免疫表型(表1)。

2.2 K562/MDR1-DC的抗原递呈功能 通过MTT法测得各组细胞对异基因淋巴细胞的刺激增殖能力(表2)。诱导培养14 d所获得的K562/MDR1-DC、K562-DC均能够刺激异体淋巴细胞增殖，其SI明显高于诱导前的K562、K562/MDR1细胞(P＜0.001);且随着S∶R比值增加，其刺激增殖的能力亦增强(P＜0.001)。在相同S∶R比值下，K562/MDR1-DC组的SI高于K562-DC组(P＜0.01);但是，两组之间的DC表型并无统计学差异(表1)，这提示高表达Pgp能增强DC的抗原递呈能力。

2.3 K562/MDR1-DC的Pgp表达及药物外排功能 流式细胞仪分析提示Pgp表达在K562细胞诱导前后有轻度变化，阳性比例从(0.93±0.52)%上调至(2.35±0.83)%(P＜0.05);而在K562/MDR1向DC的诱导分化过程中，Pgp表达则有轻度下调，从(97.18±1.61)%降至(92.72±3.64)%(P＜0.05);分化后的K562/MDR1-DC的Pgp表达远远高于K562-DC(P＜0.01，图1)。为观察细胞中Pgp介导的对DNR的外排作用，将各组细胞与1 μg/ml的DNR孵育2 h后，通过FCM检测DNR的自发荧光。图1B示，K562/MDR1及K562/MDR1-DC组的荧光强度(MFI)轻度低于敏感细胞株K562组及其诱生的K562-DC组，提示Pgp在诱导DC分化过程中能够继续稳定表达并且介导对化疗药物的外排作用(图2)。

表1 K562及K562/MDR1诱导DC前后的表型变化Table 1 The phenotypic changes during differentiation of K562 and K562/MDR1 cells into DC(%，±s)

表1 K562及K562/MDR1诱导DC前后的表型变化Table 1 The phenotypic changes during differentiation of K562 and K562/MDR1 cells into DC(%，±s)

与K562组比较，*P＜0.001;与K562-MDR1组比较，#P＜0.001;K562-DC组与K562/MDR1-DC组的各表型比较，差异均无统计学意义.

组 别 CD1αCD83 CD80 CD86 HLA-DR HLA-ABC诱导前的前体细胞K562 1.15±0.82 0.84±0.52 0.48±0.33 0.75±0.26 1.67±0.82 0.87±0.49 K562/MDR1 1.71±0.68 0.90±0.73 1.03±0.82 0.55±0.42 1.31±0.63 1.01±0.52诱导分化后的DC K562-DC 21.24±8.12*# 37.21±6.04*# 43.52±3.95*# 23.18±3.09*# 35.61±2.32*#37.26±2.34*#K562/MDR1-DC 19.31±5.76*# 43.36±4.24*# 40.11±2.75*# 27.24±5.36*# 38.06±5.03*#38.15±2.07*#

表2 K562-DC与K562/MDR1-DC刺激异基因淋巴细胞增殖的能力比较Table 2 Proliferation of allogenetic lymphocytes stimulated by K562-DC and K562/MDR1-DC

图1 K562和K562/MDR向DC分化前后的Pgp表达Fig.1 The expression of Pgp before and after differentiation of K562 and K562/MDR1 cells into DC

2.4 K562/MDR1-DC的耐药特征 在诱导分化前，转染 MDR1基因使 K562对 VCR、ADM的IC50分别提高101、235倍;在细胞因子诱导分化后，K562/MDR1-DC仍保持对 VCR、ADM的耐药特征，其IC50分别是(366.92±35.88)μg/ml及(28.43 ±6.32)μg/ml，但较诱导前下降(P＜0.05)。K562-DC对两种药物的IC50分别为(6.15±2.29)μg/ml及(0.42±0.26)μg/ml，较诱导前有所升高，但无统计学差异(P＞0.05)。以 K562/MDR1-DC与K562-DC的 IC50比值计算耐药倍数，对VCR、ADM的耐药倍数分别为60、68倍，较诱导分化前有所下降(表3)。

图2 K562、K562/MDR向DC分化前后DNR外排功能Fig.2 The efflux of DNR before and after differentiation of K562 and K562/MDR1 cells into DC

表3 K562/MDR1与K562细胞在向DC分化前后对ADM和VCR的药敏试验Table 3 The sensitivity of K562/MDR1-DC and K562-DC cells to vincristine and adriamycin

3 讨论

由MDR1基因编码的分子量为170 kD的膜糖蛋白Pgp的过度表达是介导白血病多药耐药的经典机制［5］。Pgp的高表达往往与白血病的化疗耐药及不良预后密切相关。一些Pgp的拮抗剂如维拉帕米、环抱素A可通过竞争底物来逆转MDR1，然而真正能取得满意临床疗效的甚少。我们在前期研究中发现，将表达Pgp的耐药白血病细胞与DC融合可以诱导针对Pgp的特异性细胞毒性T细胞应答，这表明Pgp蛋白作为耐药细胞表面标记的同时还可以作为白血病免疫治疗的靶分子，诱导针对耐药白血病的免疫应答。为此，我们提出如下设想:如果将外源MDR1基因导入DC前体细胞，那么诱生的DC将高表达Pgp。其一方面可以诱生出Pgp特异的CTL应答，特异杀伤耐药细胞;另一方面有可能使得DC获得对多种化疗药物的抗性，这对化疗后的免疫重建，以及免疫治疗与化疗双联应用成为可能。

为了验证这一设想的可行性，我们首先检测转染MDR1进入DC前体细胞是否影响其向DC分化的能力。采用慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞作为DC分化的细胞模型。K562具有向巨核、红系、单核细胞系多系分化的潜能，在PMA或者细胞因子组合诱导下，能够向DC样细胞分化，上调DC相关的表面标记，显示对同种异体淋巴细胞的刺激增殖能力，因而K562细胞可以作为DC分化研究的细胞模型［6-7］。通过 MDR1基因转染 DC前体细胞K562，发现与亲代 K562类似，K562/MDR1在细胞因子组合作用下能够分化为白血病来源的DC，上调 DC相关的表面标志，如 CD1a和CD83以及HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原，协同刺激分子CD80和CD86等的表达。这些标记的表达水平与未转染的K562诱导组比较无统计学差异，证明转染MDR1基因并不影响K562细胞向DC的分化。

在此细胞模型基础上，我们还证实了MDR1基因在细胞因子诱导前后能够稳定表达并且传递多药耐药特性。过度表达的MDR1基因及Pgp蛋白对DC本身功能的影响尚无明确报道。在生理情况下，Pgp作为一种跨膜转运泵，功能性表达于多种免疫细胞，可能通过介导细胞内可溶性底物的跨膜运转发挥免疫调节功能，在DC的迁移、抗原递呈过程中发挥重要作用［8-9］。Schroeijers等［10］发现，在人 DC 前体细胞向DC分化过程中，Pgp蛋白的表达轻度上调。Lee等［11］报道，Pgp在小鼠骨髓来源的DC的分化发育过程中起着重要作用，并且在DC的分化成熟过程中MDR-1基因和Pgp蛋白上调;通过文拉法辛下调Pgp的表达则可抑制DC的分化和成熟过程中细胞因子IL-1、IL-10及IL-12的产量。本研究结果也显示，K562细胞在向DC分化过程中Pgp表达有轻度上调。但是，K562/MDR1分化为DC后Pgp的表达反而轻度下调，这可能是由于外源转染的MDR1基因的表达与生理条件下的调节机制不同有关。在DC相关表型无显著差异的情况下，高表达Pgp的K562/MDR1-DC较K562-DC在Allo-MLR中显示更强的抗原递呈功能，提示Pgp高表达可能有利于增强DC的抗原递呈功能。与Pgp的高水平表达一致，分化后的K562/MDR1-DC仍保持多药耐药特性，对DNR的外排增加，对ADM及VCR的IC50明显高于敏感细胞株诱导的K562-DC。

DC作为功能最强的专职抗原递呈细胞，能有效递呈白血病抗原，启动特异抗白血病的T细胞应答。DC疫苗结合传统化疗的治疗模式已成为清除微小残留病变和防止白血病复发的希望所在。但是化疗后常导致DC等免疫细胞的清除及功能受损，必然消减了DC疫苗的疗效。因而，通过转染MDR1基因获得高表达Pgp的具有多药耐药特征的DC具有重要意义。①Pgp参与DC的迁移、抗原加工及递呈、自分泌及旁分泌等多种生理功能，高表达后可能更有利于DC抗原递呈功能的执行;②高表达Pgp可以使得DC获得多药耐药特征，从而抵抗化疗药物对其清除作用，在免疫应答始动环节发挥免疫监视作用，有利于化疗后的免疫重建及监视，并且使得免疫治疗与化疗可以同时进行;③Pgp蛋白具有免疫原性，可被DC有效递呈，诱导针对Pgp的特异性CTL应答，从而为白血病多药耐药的免疫治疗提供新靶点。

本研究中以白血病细胞株为模型可能不能完全代表正常的DC分化过程，尚需进一步开展在正常DC前体细胞，如CD14+单核细胞及CD34+造血干细胞中转染MDR1基因的研究。

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