低氧细胞应激的HIF-1信号通路

王苹苹，孔繁平，陈学群，杜继曾 综述

(浙江大学医学院基础医学系，浙江 杭州 310058)

氧是机体进行新陈代谢的必需物质，缺氧对机体和细胞是一种强烈的应激。细胞通过氧感受器和信号转导通路特异地调节某些基因或蛋白的表达来适应低氧［1］。HIF-1α是哺乳动物维持氧平衡最主要的调节因子。近10年来，低氧研究主要集中在HIF-1α介导的基因转录调控方面。低氧可以增加HIF-1的稳定性，促进HIF-1与低氧反应元件(hypoxia response element，HRE)的结合，从而诱导低氧靶基因的激活。此外，HIF通路和其它信号通路间也存在交叉调节，形成了细胞低氧应答的特异性和多样性。

1 低氧诱导因子HIF-1

1.1 HIF-1的基本结构 HIF-1是由分子量为120 kD的 HIF-1α和分子量为91－94 kD的HIF-1β或称芳香烃受体核转位蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT)2种亚基组成的异源二聚体［2］，2亚基均属于basic helix-loop-helix(bHLH)/PER-ARNT-SIM(PAS)家族蛋白［3］，N 末端均含有 bHLH/PAS同源区。bHLH区和N末端PAS中间区对于二聚化以及与靶基因的结合必不可少。HIF-1α亚基的中部有一个氧依赖降解结构域(oxygen dependent degradation domain，ODDD);C 端是反式激活区，包括2个反式激活域(transactivation domain，TAD)即 TAD-N(amino acids 531-575)和TAD-C(amino acids 786-826);2个TAD序列间的区域为抑制结构域(inhibitory domain，ID;amino acids 576-785)，抑制TAD的转录激活［4］。

HIF-α 亚基包括 HIF-1α、HIF-2α 和 HIF-3α，这3种HIF-α的亚型都由氧来调节其蛋白的稳定性，在低氧条件下可以与HIF-1β结合调节靶基因的转录。HIF-1α和HIF-2α在结构上有48%的氨基酸序列是相同的，能识别同样的DNA结合区，但各自又有独特的生物学效应。有研究表明，HIF-2α参与长期慢性的低氧反应，而 HIF-1α 则与急性低氧反应有关［5］。HIF-3α不诱导激活 HIF的靶基因，大鼠HIF-3α有1个仅包含bHLH和PAS区的IPAS蛋白(inhibitory PAS domain protein)，IPAS对HIF调节的基因表达可能起负反馈抑制作用，IPAS可以和HIF-1α结合形成没有功能的二聚体，这个二聚体在细胞核内不能与靶基因的低氧反应元件结合，形成了一种细胞特异或环境特异的应对低氧的策略［6］。

1.2 HIF-1α蛋白的功能调节 HIF-1α位于细胞质中，在常氧下极易降解，半衰期不足5 min;但在低氧下HIF-1α稳定性和转录活性都显著增加，其主要有2条氧依赖的途径调节HIF-1α蛋白稳定性和转录活性:①FIH-1(factor-inhibiting HIF-1)是一种氧依赖性酶，可将HIF-1α C末端反式激活结构域内803位的天冬氨酸残基羟基化，阻止HIF-1α与转录辅助激活因子CBP(CREB-binding protein)/p300结合，从而抑制 HIF-1α 的转录激活功能［7］。②脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase，PHDs)也是氧依赖性酶，可以使HIF-1α的564位(HIF-2α的531位)和402位的脯氨酸残基被羟基化，然后肿瘤抑制蛋白(von hippel-lindau protein，pVHL)与 HIF-1α亚基的 ODDD结合，募集多种泛素蛋白，共同组成泛素连接蛋白酶复合体，使HIF-1α亚基泛素化，并经泛素连接蛋白酶复合体途径降解［8］。不同组织中PHDs的表达不同，与不同HIF蛋白的亲和力也不尽相同，这可能导致了低氧应答的多样性。在低氧下，PHDs和FIH-1的活性被抑制，HIF-1α不被降解，导致胞内蛋白水平迅速增加。在HIF-1α蛋白C末端有核定位信号(NLS)，辅助HIF-1α蛋白快速和核孔蛋白结合入核。HIF-1β在缺氧及正常细胞的胞浆和核中均存在，其与HIF-1α的N末端激活域结合，形成二聚体后与CBP/p300结合开始转录。

HIF-1α在转录后可被 SUMO(small ubiquitin-like modifier)修饰，这是一个被SUMO特异性连接酶催化和被SUMO特异性蛋白酶(SENPs)逆转的动态过程。这些生理过程现在并未研究清楚，有些报道也有矛盾之处。HIF-1α活性的增加和抑制都有报道，而且低氧可以增加 HIF-1α 的 SUMO 修饰［9］，而 SUMO 修饰能通过脯氨酸残基的羟基化来增强HIF-1α和VHL的结合，导致HIF-1α的泛素化降解。相反，SENPs参与的HIF-1α去SUMO修饰可以避免其在低氧下被降解［9］。HIF-1β同样能被SUMO修饰，调节与其它蛋白的关系［10］。但是，这种SUMO修饰对HIF-1β和HIF-α蛋白的相互作用机制目前尚不清楚。

最近，研究者发现了很多可以调节HIF-1α活性的蛋白质和小分子物质。HIF-1α可以被NO介导的亚硝基化修饰，从而增强常氧条件下的蛋白稳定性和活性［11］。热休克蛋白90(heat shock protein 90，Hsp90)可以氧依赖的结合在HIF-1α的PAS区，阻止HIF-1α的泛素化降解。RACK1(receptor for activated protein C kinase 1)与Hsp90竞争结合在HIF-1α的PAS结构域，从而增加 HIF-1α的降解。17-AAG(17-allylaminogeldanamycin)是 Hsp90的抑制物，它可以阻断Hsp90与HIF-1α的结合，促进RACK1的结合，激活HIF-1α泛素化降解［12］。

2 低氧反应元件HRE

HRE是一个复杂的调节元件，由保守的HIF-1结合位点(HIF-1 binding site，HBS)A/GCGTG和高度可变的旁侧序列组成［13］。HIF-1α亚基稳定后向核内转移，与β亚基二聚化形成HIF-1结合在低氧反应元件HRE上。与HIF通路调控相比，目前对HRE序列的特征了解还很少，只知道在低氧转录激活作用中HRE是最小的一个顺式调节元件［14］。100多个研究表明，在有功能的HBS序列中特定核苷酸有特定的位置，也就是说HBS的核心序列呈现非随机性，不一定就是 N(－3)N(－2)A/G(－1)C(1)G(2)T(3)G(4)。A在－1位置的概率是4.5倍，而T出现在 －3位置的概率是4.2倍［13］。有一些研究报道了HRE序列与它调控功能之间的关系，比如突变分析－2位置发现低氧诱导作用按 T＞G＞C的顺序下降。回文序列CACGTG之所以低氧诱导作用低可能是该序列竞争结合了一些抑制因子，如HIF-1β的同源二聚体。内皮素1(endothelin-1，ET-1)的 HRE AACGTG的低反应性也认为HBS序列－2位置的核苷酸有重要关系［16］。

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因转录起始点上游大约1 kb的5'侧翼区域有286 bp的HRE。HRE区域内存在HBS 5'ATCGTGGG3'和HIF-1结合的辅助序列(HIF-1 ancillary sequence，HAS)5'CACAG3'［16］。两者是低氧 VEGF 转录激活的顺式作用元件，调控VEGF在低氧条件下的转录。EPO基因的3'端上存在一个低氧反应元件，HIF-1识别5'-TACGTGCT-3'，特异性地结合在这个反应元件上，调节EPO基因在低氧下的转录水平［3］。最近的研究发现，人类肝癌细胞(HepG2)转染含有类胰岛素样生长因子结合蛋白1(insulin-like growth factor binding protein，IGFBP-1)调控区，分别暴露于20% 和1% 氧浓度24 h，结果发现HIF-1结合在斑马鱼胚胎的IGFBP-1基因调控区的HBS上。－1086/－1090处的 HBS 3'-ACGTG-5'和 －1099/－1103处HAS 3'-CAGGT-5'对于低氧诱导IGFBP-1的表达都是重要的［17］。HAS位于HRE上游8 bp处，在HIF-1诱导斑马鱼IGFBP-1的激活中是必不可少的。HAS并不是直接与HIF-1作用的，也不影响它邻近HRE与HIF-1的结合。常氧条件存在一种核蛋白与HAS相结合，而这种物质以及它的作用目前尚不清楚。但是，在铁转运蛋白中HRE是由2个邻近的HBSs形成，在各种糖分解的酶以及葡萄糖转运体中HRE是由邻近2或3个HBSs组成的［18］。

一个HBS是必要的，但是不足以激活低氧反应，高度可变的旁侧序列结合其它不一定与低氧有关的转录因子，使HRE调节达到顶峰，这对于增强低氧反应或形成HRE的细胞特异性有重要作用［8］。在乳酸脱氢酶 A(lactate dehydrogenase A，LDHA)基因的HRE中有转录激活因子1和cAMP反应元件结合蛋白-1(ATF-1/CREB-1)的结合位点［19］。GATA 结合转录因子2(GATA-binding transcription factor-2，GATA-2)和AP-1元件对于ET-1的高表达是必要的［20］。VEGF基因HRE中发现AP-1的结合位点，在EPO基因HRE中有肝细胞核因子4(hepatic nuclear factor 4，HNF-4)的结合位点［21］。HRE的多样性可能增强了低氧反应性和不同组织的反应特异性，丰富了靶基因的多样性［18］。

3 HIF-1在不同疾病中的作用

HIF-1通过激活靶基因的转录，在低氧相关的生理状态和病理过程中发挥作用，目前已知有70多种基因受HIF-1调节［22］。

3.1 HIF-1在缺血诱导的血管生成中的作用 HIF-1的活性对于组织缺血后的恢复是十分必要的。HIF-1可以上调与血管系统相关蛋白的基因表达，如促进血管生成的VEGF及其受体;使血管收缩的物质，如诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、ET-1 和血红素氧化酶1(heme oxygenase-1，HO-1)等来增加血流，降低缺血损伤。在HIF-1α基因敲除的股动脉结扎模型中，发现VEGF等血管生长因子没有被激活，缺血后再灌注能力降低［23］。在其它的损伤模型中也发现，HIF-1α的促血管生成作用，包括心肌肥大、心肌梗塞、伤口愈合和视网膜血管再生等模型［24-26］，而 HIF-2α在这些模型中的促血管生成作用并不明显［27］。这些结果表明，HIFα尤其是HIF-1α在缺血组织中介导促血管生成的作用。此外，在胚胎发育中，HIF-1对胚胎血管系统的建立和发育也至关重要［28］。

3.2 HIF-1在缺血后细胞代谢中的作用 在动脉粥样硬化疾病中，心脏、脑和肌肉这些组织都可能处于缺血状态，HIF-1的激活对它们适应缺血起关键作用。HIF-1参与重建细胞代谢途径来实现对心脏和脑组织的保护。因为氧作为线粒体呼吸电子传递链的受体，低氧适应的关键是将代谢途径转到非氧化的碳代谢和ATP产生途径，如糖酵解。HIF能启动葡萄糖转运体和LDHA来介导这个通路的转换。HIF-1的另一个靶基因丙酮酸脱氢酶激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase-1，PDK1)编码的 PDK蛋白可以抑制乙酰辅酶A的合成，阻断三羧酸循环，降低氧消耗［29］。HIF-1缺失的细胞在低氧后ATP产量降低，产生更多的氧自由基，促使其凋亡［29］。最近的研究显示，HIF-1的激活还能影响磷酸戊糖途径［30］，这条途径能将糖酵解的中间产物转化为合成核苷酸的重要原料5-磷酸核糖。这些研究结果表明，HIF-1依赖的代谢通路的转换，能促进细胞在低氧下存活，而且HIF-1将葡萄糖代谢转换成RNA和DNA合成所需的一个步骤，这对于低氧肿瘤细胞的存活和生长可能有重要意义。

3.3 HIF-1在癌症发生中的作用 肿瘤细胞的快速增殖导致血液供应不足使肿瘤细胞经常处于低氧环境，所以肿瘤组织中HIF通常高表达［32］。此外还有一些非低氧依赖激活HIF的途径，比如在肾癌细胞中VHL的突变，在结肠癌中Wnt通路的突变导致 HIF稳定性的提高［32］。研究显示，HIF调节的不同靶基因在多种肿瘤的发生发展过程都有关键作用，包括增殖(Myc家族、IGF家族)、血管生长(VEGF、EPO)、凋亡/自噬(BNIP3、NIX)、代谢(PDK1、LDHA)、DNA损伤(GADD45A)、胞内基质重构(MMP1、LOX)、细胞迁移和逃逸(CXCR4)［32］。然而，不同的HIFα亚基在肿瘤发生中有不同的功能，在VHL敲除的细胞研究中显示，可能是HIF-2α而不是HIF-1α对于肿瘤发生是必需的［32］，一种可能的解释是 HIF-1α 抑制了 Myc的功能［33］。另外，低氧HIF-1α能与p53结合，诱导p53的稳定和细胞凋亡［34］。相反，HIF-2α间接抑制p53的活性而提高肿瘤细胞对辐射和化学物质的抵抗［35］。目前以HIF为靶点的研究给癌症治疗提供了新的策略。

3.4 HIF-1在细胞自噬中的作用 低氧(氧浓度＜3%)和缺氧(氧浓度＜0.1%)都能诱导细胞的自噬甚至是凋亡，然而这两种情形有不同的分子机制。低氧引起的自噬是HIF依赖的途径，而缺氧引起的自噬则是非HIF依赖的途径［36-37］。在低氧下(氧浓度1% ～3%)，HIF 激活BNIP3和NIX(BNIP3L)的转录，进而抑制Beclin1和Bcl-2的功能［38］，导致细胞凋亡。另外，位于线粒体外膜的NIX表达WXXL基序，其被LC3识别并结合，导致线粒体产生自噬。BNIP3的转录还可以被转录因子FOXO3激活，而FOXO3和HIF共同被Sirt1所调节［39］。

3.5 HIF-1在炎症反应中的作用 发生炎症的时候，局部血管通透性增强，导致更多的免疫细胞到达炎症部位。因为血流减慢，炎症细胞和抗原耗氧量增加导致炎症部位形成局部低氧环境。在关节炎、动脉硬化和自身免疫性疾病患者的相应炎症部位都发现了低氧环境和HIF的激活［40］。免疫细胞对低氧的应答和 NF-κB信号通路密切相关。在巨噬细胞、中性粒细胞和一些非免疫细胞中发现，HIF可以激活NF-κB［40］。低氧可以抑制 PHD1的活性，导致IKK的激活，进而磷酸化IκB，解离出的NF-κB导致下游基因的转录激活，如炎症因子［41］。在巨噬细胞中NF-κB直接调节HIF-1α的转录。缺乏IKK的巨噬细胞即使在低氧下也不能形成稳定的HIF-1α蛋白，但是，只有NF-κB的激活同样不能使HIF-1α稳定，这些结果显示，HIF-1α的激活需要NF-κB和低氧的共同调节。而HIF-2α 在低氧下的激活则不需要 IKK［42］。缺乏HIF-1的巨噬细胞表现出迁移能力降低，吞噬细菌能力减弱，炎性细胞因子的分泌降低。

3.6 HIF-1在机体系统性低氧中的作用 除了上述病理状态下的低氧或缺氧，HIFα在机体的生理低氧状态中也发挥重要作用，如进入高原或者剧烈运动后，造血器官通过增加红细胞数目来增加血液的携氧能力，而这个过程是由HIFα的靶基因EPO所介导的［43-44］。人和小鼠上的研究表明，成年个体EPO水平和造血能力受PHD-2/VHL/HIF-2α通路调节。家族性红细胞增多症是一种血红蛋白和红细胞异常增多的遗传病，研究表明，这种疾病是由于VHL发生突变使HIF-1α不能在常氧下降解，从而激活EPO导致的［44］。最近，关于世居高原的藏族人和汉族人的基因组研究发现了PHD-2/VHL/HIF-2α 通路的进化［45-47］，等位基因 SNP的显著差异发生在PHD-2和HIF-2α基因上，或者是靠近这些基因的位置。由此推测，藏族人的PHD-2和HIF-2α受到青藏高原物理环境的选择压力而产生了突变，赋予藏人适应青藏高原的能力。最直接的表现就是藏族人对慢性高原病有强的抵抗力，而慢性高原病的发生与低氧靶基因EPO介导的造血能力提高有关。青藏高原动物和实验动物小鼠的比较研究发现，低氧激活小鼠肝脏HIF-1α高表达，但没有激活高原属兔和根田鼠肝脏HIF-1α表达，而低氧靶基因IGF-1、IGFBP-1和LDH转录展示出“多模式化”调节方式［48］，高原动物青海湖裸鲤HIF-1α进化速率分析发现，低温因素对HIF-1α进化的影响大于低氧因素对其影响，其靶基因Glut1的转录受低氧调节，表现出组织特异性差异，在低氧下脑和肝脏Glut1 mRNA表达明显比肌肉和心脏低［49］。

图1 低氧信号通路和Notch、Myc信号通路的交叉调节Fig.1 Hypoxia signaling pathways crosstalk with Notch and Myc pathways

4 HIF信号通路和其它信号通路的相互调节

信号通路的相互调节是当前研究的热点，也是细胞对不同的外部信号应答的重要方式。研究表明，Myc和Notch信号通路对低氧反应通路有调节作用(图1)。Myc转录因子家族在细胞生长、分化、凋亡和代谢中有关键作用。Myc基因的过度表达促进肿瘤细胞的转化和增殖［50］。Myc和细胞低氧反应的相互调节通路至少有3条。首先，低氧激活HIF-1α后通过下调Myc靶基因抑制 Myc，导致细胞周期停滞［51］。第二，HIF-1α参与低氧抑制的细胞周期及DNA修复相关的基因表达，通过在Myc激活的启动子区竞争MYC的结合位点，从而抑制MYC的反式激活［52］。第三，低氧依赖的MXI1激活可能负性调节MYC［53］。MXI1是一个潜在的肿瘤抑制因子，通过与转录抑制蛋白及MYC的伴侣分子MAX相互作用来抑制MYC，从而抑制MYC-MAX异二聚体复合物表达。HIF-1α和HIF-2α都可以诱导MXI1抑制MYC的活性。HIF-2α还可以与MAX作用，激活MYC基因的转录活性，从而促进细胞的生长［33］。

低氧的细胞反应和Notch通路的相互调节同样复杂，并且存在于多个层次。首先，低氧通过上调Notch配体DLL1和DLL4转录水平，增强Notch信号［54］。其次，HIF-1α 和 Notch胞内结构域(Notch ICD)之间可以发生直接作用。HIF-1α被募集到Notch ICD的转录复合物上，结合Notch相应的启动子来激活Notch靶基因［52］。HIF-1α和 Notch ICD的相互作用可能是低氧稳定Notch ICD的基础。第三，FIH-1不仅使HIF-1α羟基化也使Notch ICD羟基化［55］。FIH-1抑制 Notch信号，相比于 HIF-1α，FIH-1更容易与Notch ICD结合，因此影响了FIH-1介导的 HIF-1α 转录活性的抑制［56］。

综上所述，低氧可以出现在很多生理和病理过程中，HIF-1在细胞、组织和器官的低氧损伤和适应过程中有关键的调控作用。目前很多研究针对HIF-1蛋白稳定性的调节，关于HIF-α蛋白质翻译后修饰如何影响DNA结合、转录以及与其它相关蛋白间的相互作用，以及低氧信号转录的精确过程尚待进一步研究。

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