HIF-1α在结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤血管生成中的作用及意义

唐琼兰， 陈 瑞， 刘卫平， 李海刚， 林敏玲， 何欣欣

(中山大学孙逸仙纪念医院 1病理科，2呼吸内科， 广东 广州 510120； 3四川大学华西医院病理科，四川 成都 610041)

HIF-1α在结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤血管生成中的作用及意义

唐琼兰1，3， 陈 瑞2△， 刘卫平3， 李海刚1， 林敏玲1， 何欣欣1

(中山大学孙逸仙纪念医院1病理科，2呼吸内科， 广东 广州 510120；3四川大学华西医院病理科，四川 成都 610041)

目的研究缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤血管生成中的作用及意义。方法采用免疫组化法检测50例人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤中HIF-1α、血管内皮生长因子(VEGF)和血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的表达情况，用CD34单克隆抗体标记血管内皮细胞，并计算肿瘤微血管密度(MVD)，用SPSS 13.0软件分析HIF-1α与VEGF、VEGFR2及肿瘤MVD的相关性。结果(1)50例中有39例(78%)肿瘤细胞HIF-1α阳性，27例(54%)VEGFR2阳性，与淋巴结反应性增生组织中淋巴细胞的表达情况比较均有显著差异(P<0.05)；(2)HIF-1α蛋白阳性表达组VEGF和VEGFR2的阳性表达率分别为72%和64%，明显高于HIF-1α蛋白阴性表达组(P<0.05)；(3)HIF-1α、VEGFR和VEGFR2蛋白表达与肿瘤MVD相关(P<0.01)；(4)15例伴有血管中心性浸润的结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤病例均表达HIF-1α。结论HIF-1α可促进结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤肿瘤血管生成，其作用机制可能与VEGF/VEGFR2通路有关。

淋巴瘤; 自然杀伤/T细胞; 缺氧诱导因子 1α; 血管生成

结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤(extranodal nasal-type NK/T-cell lymphoma)是一类具有特殊形态、免疫表型和生物学行为的侵袭性淋巴瘤，该肿瘤细胞常表达T细胞分化抗原及自然杀伤(natural killer, NK)细胞相关抗原，故得此名[1，2]。结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤在亚洲尤其在中国发病率较高，欧洲和北美地区少见[1，2]，多发生于结外器官或组织，具有血管破坏性和血管中心性浸润的特点，但其发生机制尚不清楚。课题组研究发现血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤肿瘤细胞中表达上调，可能与该肿瘤血管生成及预后有关[3]。国内外研究发现，缺氧诱导因子-1α( hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α)可调控VEGF的转录活性，与多种淋巴瘤血管生成有关[4-6]。目前尚未见有关HIF-1α与结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤血管生成的报道。因此，本研究采用免疫组化法检测50例人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤病例HIF-1α、VEGF和血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2)的表达，分析HIF-1α与VEGF、VEGFR2及肿瘤微血管密度(microvessel density， MVD)的相关性，初步探讨HIF-1α在结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤血管生成中的作用及临床意义。

材 料 和 方 法

1病例资料

收集中山大学孙逸仙纪念医院2000年1月-2010年1月外检诊断的结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤病例60例。诊断标准参照新版WHO关于淋巴造血组织肿瘤分类(2008)[1]进行，排除病变组织太少者10例，其余50例被纳入本研究。本组病例年龄16-67岁，中位年龄38岁；男性30例，女性20例。首发部位以鼻腔最多见(23/50，46%)，其次为咽(12/50，24%)、硬腭(3/50，6%)、软腭(3/50,6%)及上颌窦、扁桃体、会厌、颌下、肺、胃、小肠、结肠和睾丸(各1例，18%)。15例可见血管中心性浸润。

2材料与试剂

HIF-1α鼠抗人单克隆抗体(SC-53546)和VEGFR2鼠抗人单克隆抗体(SC-6251)均购自Santa Cruz Biotech；VEGF(ZM-0265)和链亲和素-过氧化物酶( streptavidin-biotin immunoperoxidase, SP)试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；CD34(GM716510)购自基因有限公司。

3方法

采用SP法。HIF-1α、VEGF、VEGFR2和CD34抗体的工作稀释度分别为1∶50、1∶100、1∶80和1∶50。抗原修复方法参照试剂说明书进行。以乳腺浸润性导管癌组织为阳性对照，以PBS代替Ⅰ抗作为空白对照。

以同期10例淋巴结反应性增生标本为对照比较淋巴造血组织良、恶性病变中HIF-1α、VEGF和VEGFR2表达情况。

4结果判定

HIF-1α、VEGF和VEGFR2结果判定方法: HIF-1α以细胞核或细胞核及部分胞质呈淡黄色或棕黄色为阳性，VEGF和VEGFR2均以胞质呈淡黄色或棕黄色为阳性；随机选择5个高倍(×400)视野，合并计算所分析的5个不同视野染色细胞百分数及染色强度，根据阳性细胞的百分率及显色深浅计分：(1)阳性细胞的百分率:阳性细胞率0-5%计0分；6%-25%计1分；26%-50%计2分；≥51%计3分。(2)显色深浅:不显色或显色不清楚计0分；淡黄色计1分；棕黄色计2分；深褐色计3分。以阳性细胞的百分率及显色深浅评分之和3-6分为阳性。

CD34以血管内皮细胞的细胞膜棕黄色为阳性。参照文献[7]介绍方法对CD34染色切片进行观察，计算MVD。

5统计学处理

结 果

1HIF-1α、VEGF及VEGFR2在肿瘤细胞及正常淋巴细胞中的表达

实验组50例结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤病例中，39例(78%)肿瘤细胞表达HIF-1α(图1A)，3例(3/10，30%)淋巴结反应性增生组织呈阳性表达(淋巴滤泡生发中心少数B细胞和浆细胞呈弱阳性表达)，两组比较，2= 9.143，P<0.01，差异显著。32例(64%)肿瘤细胞表达VEGF(图1B)，与淋巴结反应性增生组织中淋巴细胞的表达情况比较，2= 0.057，P>0.05，无显著差异。27例(54%)结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤病例肿瘤细胞表达VEGFR2(图1C)，淋巴结内正常淋巴细胞VEGFR2呈阴性或极少数细胞表达，2=6.482，P<0.05,见表1。

表1HIF-1α、VEGF及VEGFR2在肿瘤细胞及正常淋巴细胞中的表达

Table 1. The expression of HIF-1α, VEGF and VEGFR2 in tumor cells of extranodal nasal type NK/T-cell lymphomas and normal lymphocytes of lymph nodes

GroupHIF-1αVEGFVEGFR2nPositiveNegativenPositiveNegativenPositiveNegativeNK/T-celllymphomas5039(78%)115032(64%)185027(54%)23Normallymphocytes103(30%)7106(60%)4101(10%)9

2HIF-1α表达与VEGF、VEGFR2的关系

在人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤病例肿瘤细胞中, HIF-1α蛋白阳性表达组VEGF和VEGFR2的阳性表达率分别为72%和64%，与HIF-1α蛋白阴性表达组比较，2= 4.675，P<0.05及2= 7.284，P<0.01，差异显著。VEGF蛋白阳性表达组VEGFR2的阳性表达率为75%，与VEGF蛋白阴性表达组比较，2= 15.781，P<0.01，差异显著，见表2。

表2HIF-1α与VEGF、VEGFR2及肿瘤MVD的相关性

Table 2. The correlative analysis between the expression of HIF-1α and VEGF, VEGFR2 and MVD in human extranodal nasal type NK/T-cell lymphomas

GroupVEGFVEGFR2MVD(x±s)nPositiveNegativenPositiveNegativeHIF-1α(positive)3928(72%)113925(64%)1435．8±5．4∗∗HIF-1α(negative)114(36%)7112(18%)927．0±6．5VEGF(positive)3224(75%)837．0±4．5∗∗VEGF(negative)183(17%)1528．1±7．4VEGFR2(positive)41．6±5．3∗∗VEGFR2(negative)24．7±6．4

**P<0.01vscorresponding negative group.

3HIF-1α、VEGF和VEGFR2表达与肿瘤MVD的关系

HIF-1α蛋白阳性表达组MVD最低为11.3，最高为55.8，平均为35.8，HIF-1α蛋白阴性表达组MVD最低为5.6，最高为34.2，平均为27.0，两组比较，差异显著(P<0.01)，说明HIF-1α蛋白表达水平高者MVD大，HIF-1α蛋白表达与结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤肿瘤血管形成有关，见表2。

VEGF蛋白阳性表达组MVD最低为5.6，最高为55.8，平均为37.0，与VEGF蛋白阴性表达组比较，差异显著(P<0.01)；VEGFR2蛋白阳性表达组MVD最低为9.5，最高为55.8，平均为41.6，与VEGFR2蛋白阴性表达组比较，差异显著(P<0.01)，说明VEGF和VEGFR2可能具有促进结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤肿瘤血管形成的作用。

4HIF-1α、VEGF和VEGFR2表达与血管中心性浸润的关系

15例伴有血管中心性浸润的结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤病例均表达HIF-1α，无血管浸润者HIF-1α阳性率为69%，两组比较，差异显著。13例表达VEGF和12例表达VEGFR2，与无血管中心性侵润病例比较，P<0.05，差异显著。结果说明，HIF-1α、VEGF和VEGFR2蛋白表达与结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤血管中心性浸润有关。

表3 HIF-1α、VEGF及VEGFR2与血管中心性浸润的关系

Figure 1. HIF-1α, VEGF, VEGFR2 and CD34 expression in the tumor tissues of human extranodal nasal-type NK/T-cell lymphoma (SP, ×200 ).A: HIF-1α; B: VEGF; C: VEGFR2; D: CD34.

图1结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤中HIF-1α、VEGF、VEGFR2及CD34的表达

讨 论

结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤在亚洲及南美洲地区多见，据不完全统计，在不同地区，该肿瘤在所诊断的淋巴瘤中占的比例分别为：西方国家0.17%，北京7%，香港13%，广州7%，成都18%，该类肿瘤可谓是中国的“特产”之一[2，8]。近年来其发病率呈上升趋势，严重威胁着我国青壮年人口的生命。因此，加强结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的发病机制研究，积极寻求针对该类疾病的特异性治疗方案是目前防治该类肿瘤的当务之急。

缺氧是实体肿瘤的普遍特征，肿瘤缺氧促进了肿瘤细胞的侵袭生长和对化、放疗的抵抗作用。缺氧诱导因子HIF-1α是应答缺氧的关键调控基因，它的活性与肿瘤血管生成密切相关[9]。HIF-1α还能增强其下游靶基因的表达，其中VEGF及其受体编码基因是HIF-1α最主要的靶基因。VEGF是目前已知专属性最强的血管生成因子，通过与其受体VEGFR2结合激活多种信号转导通路，刺激血管内皮细胞增殖和迁移，促进血管生成，并增加血管通透性，在肿瘤的生长和转移中起着重要作用[9,10]。Skinner等[11]发现VEGF的转录活性可由HIF-1α、HDM2 和p70S6K1在PI3K/Akt信号中调节的, HIF-1α的表达通过活化PI3K/Akt信号通路在转录水平介导VEGF蛋白的表达,而HDM2和p70S6K1是Akt下游的两个生长因子，能增强VEGF的转录活性和HIF-1α的表达。

研究发现HIF-1α和VEGF及其受体VEGFR2在多种淋巴瘤中广泛表达[3-7，10]，并与多种淋巴瘤预后有关。Evens等[12]研究发现：高度恶性非霍奇金淋巴瘤中HIF-1α阳性表达率明显高于低度恶性非霍奇金淋巴瘤，这可能与肿瘤的生长速度及血管形成有关，肿瘤的生长速度越快，缺氧越严重，缺氧引起肿瘤细胞内 HIF-1α 蛋白的积聚和核转位，结合于 VEGF的启动子区域的低氧反应元件(HRE)从而激活 VEGF的转录，激活VGEF/VEGFR2信号通路，促进肿瘤血管形成及微血管密度增加，VEGF和VEGFR2结合并激活后将细胞膜/细胞质激酶级联反应信号传递到细胞核内，进而引起内皮细胞的一系列变化，包括内皮细胞黏附、迁移、增殖、存活，最终导致新生血管形成[9,10]。本实验结果发现，结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤中HIF-1α阳性率为78%，而反应性增生淋巴组织中仅有少数正常淋巴细胞呈弱阳性表达。研究结果提示：HIF-1α表达上调可能是淋巴瘤发生的重要分子事件。

本研究在对50例结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的研究中发现：结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤病例肿瘤细胞HIF-1α、VEGF和VEGFR2阳性表达率高，而淋巴结反应性增生患者的淋巴结内淋巴细胞HIF-1α和VEGFR2呈阴性或极少数细胞表达。HIF-1α蛋白阳性表达组VEGF和VEGFR2的阳性表达率分别为72%和64%。HIF-1α与VEGF/VEGFR2有关。15例伴有血管中心性浸润的结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤病例均表达HIF-1α，而且HIF-1α、VEGF和VEGFR2蛋白表达与结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤血管中心性浸润有关。同时研究发现，HIF-1α、VEGF和VEGFR2蛋白阳性表达组微血管密度较对照组高，差异显著。上述结果显示：HIF-1α与结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤独特的生物学行为有关，可促进结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤肿瘤血管生成，其作用机制可能与VEGF/VEGFR2通路有关。

缺氧是淋巴瘤的基本特征，在其乏氧应答过程中，HIF-1α的活化处于中心地位，故通过调节人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤HIF-1α的活性，可以降低VEGF的转录水平而抑制肿瘤细胞生长和转移；同时通过抑制乏氧细胞来提高淋巴瘤肿瘤细胞对放、化疗的敏感性。因此，深入研究HIF-1α在人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的调节机制有助于开拓新的肿瘤治疗思路。

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AngiogeniceffectofHIF-1αonextranodalnasal-typeNK/T-celllymphoma

TANG Qiong-lan1,3, CHEN Rui2, LIU Wei-ping3, LI Hai-gang1, LIN Min-ling1, HE Xin-xin1

(1DepartmentofPathology,2DepartmentofRespiratoryDiseases,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China;3DepartmentofPathology,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China.E-mail:gzchenrui@163.com)

AIM: To study the angiogenic effect of hypoxia inducible factor 1α(HIF-1α) and its significance on human extranodal nasal-type NK/T-cell lymphoma.METHODSThe protein levels of HIF-1α, vascular endothelial growth factor(VEGF) and VEGF receptor 2(VEGFR2) in human extranodal nasal-type NK/T-cell lymphoma were detected by immunohistochemistry. Microvessel density (MVD) of the tumor tissues was determined by labeling of microvessel endothelium with CD34 antibody. The correlation between the expression of HIF-1α, VEGF and VEGFR2 and MVD was analyzed with SPSS 13.0 statistical software.RESULTSThe positive expression of HIF-1α was observed in 39 cases (39/50, 78%) and the positive expression of VEGFR2 was 27 cases (27/50, 54%) of human extranodal nasal-type NK/T-cell lymphoma. A statistical difference of HIF-1α and VEGFR2 expression between tumor tissues and normal lymphocytes in lymph node was observed (P<0.05). In the tumor tissues, the co-expression of VEGF or VEGFR2 with HIF-1α was 72% and 64%, respectively, significantly higher than that without HIF-1α co-expression (P<0.05). The expression of HIF-1α, VEGFR and VEGFR2 was positively correlated with MVD of the tumor tissues (P<0.01). HIF-1α was expressed in all 15 cases of extranodal nasal-type NK/T-cell lymphoma with angiocentric infiltration.CONCLUSIONHIF-1α may promote angiogenesis of extranodal nasal-type NK/T-cell lymphoma through VEGF/VEGFR2 signaling pathway.

Lymphoma; Natural killer/T-cell; Hypoxia inducible factor 1α; Angiogenesis

R736.1

A

1000-4718(2011)03-0518-05

2010-08-27

2011-01-17

△ 通讯作者Tel: 020-81332590; E-mail: gzchenrui@163.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.019