阻抗法检测食品中微生物的研究进展

张爱萍，唐佳妮，刘东红

（浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州310029）

阻抗法检测食品中微生物的研究进展

张爱萍，唐佳妮，刘东红*

（浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州310029）

阻抗法作为微生物快速检测方法，可用于食品中菌落总数、大肠菌群、霉菌、酵母等常规微生物的快速检测；随着研究的深入，其在食品病原菌快速检测中也大有前景。综述了传统阻抗微生物检测的发展历程及阻抗法最新研究方向，旨在为今后阻抗法快速检测食品中微生物的研究奠定基础。

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微生物是食品检测中的一项重要指标，近年来食品安全问题的凸显，研究和建立食品微生物快速检测方法以加强对食品卫生安全监控越来越具有现实意义。而阻抗法在微生物快速检测应用中具有检测快速、操作简单、检测成本低等优势，迎合了食品企业内部及监管部门对食品质量安全及时监控掌管的需要。阻抗检测的具体操作：在无菌条件下，将被测食品样品加入到含有一定量、无菌的培养介质（固体/液体）的阻抗测试管内（见图1），插入电极；然后在两电极之间通以一小振幅交流电，测量两电极间阻抗值（电导值、双电层电容值、总阻抗值）变化［1-4］。其依据的原理：微生物在培养介质中生长代谢，会将大分子、电惰性的营养物质代谢分解为小分子、电活性物质，改变培养介质的阻抗特性，导致培养介质的阻抗值发生改变；从微生物接种之时起至培养介质产生可检测的阻抗变化所需要的时间称为检出时间（DT），研究表明DT值跟培养介质中微生物的初始浓度的对数值（lgN0）存在着一定的相关性，微生物初始浓度小的其DT值大，反之则小；在检测之前，建立lgN0跟DT值之间的标准曲线，根据检测到的被测微生物的DT值实现微生物数目的间接测量，据此实现微生物数目的快速测定［5-8］。而阻抗法对微生物鉴定则是依据同一微生物在不同培养基中具有不同的代谢形式，不同种类的微生物在某一特定的培养基中的阻抗变化曲线也不同，据此可实现微生物的快速鉴定［9-11］。因目前用阻抗法进行微生物种类鉴定还需要采取纯培养方式，对与混杂培养的微生物还不能进行鉴别，需先进行分离纯化，才能进行种类的鉴别，所以研究较少［11］。目前，阻抗法在微生物检测中的应用主要集中在快速检测食品中微生物的数目。本文对阻抗法检测微生物的发展历程及最新研究内容作简要综述，为今后阻抗微生物的研究奠定基础。

图1 阻抗测试管

1 阻抗法的发展历程

1898年，Stewart GN在实验中发现微生物的生长会导致培养介质电导率的改变，并在随后的英国医药协会会议上提出了阻抗微生物的概念［12］，这就是阻抗法首次提出。之后，阻抗法在微生物检测中的应用一直未引起人们的重视。直到20世纪70年代，因传统的微生物检测费时、费力；同时，可用于微生物快速检测的商业化阻抗仪的出现，研究人员开始将目光投注于阻抗法在微生物快速检测中的应用。Ur A等研究了阻抗变化值与培养介质内微生物数目变化的关系、不同微生物在同一培养介质中的阻抗变化曲线、同一微生物在不同培养介质中的阻抗变化曲线、微生物初始值不同的阻抗变化曲线、Escherichia coli在含不同剂量抑菌剂的培养介质中的阻抗变化曲线，研究结果表明阻抗法可用于抑菌剂的抑菌效果及抑菌剂的检测、微生物的快速鉴定、微生物初始数目的快速分析［10］；1977年，Hardy D等首次将阻抗法用于冷冻蔬菜的微生物污染水平的检测：分别用阻抗法和平板计数法检测357个样品的微生物的污染水平是否大于105CFU/g，得到阻抗法的准确率高达92.6%［6］。随后，Richards JCS等、Cady P等通过较系统的研究也都证明了阻抗法可用于食品中微生物的快速测定［13-14］。各研究人员通过研究也证明阻抗法可用于肉类［15］、牛奶［16-17］、果汁［18］等食品的微生物数目的快速分析。因阻抗法检测微生物是通过检测培养介质阻抗值的变化实现微生物快速分析，有些培养基虽然适合微生物的生长代谢，但是其生长代谢导致的相应的阻抗变化却不明显。这就要求阻抗培养介质不仅适合于微生物的生长，而且要求能产生相应显著的阻抗变化。为了对阻抗法检测过程中培养介质配方的选择更有方向性——既有利于被测微生物的选择性生长、又能产生显著的阻抗变化，Owens JD研究了各营养物质（蛋白质、脂肪、糖类等）对检测过程中阻抗变化的影响进行了深入的研究［19］。

酵母和霉菌，其代谢不仅不产生强离子代谢产物，相反会产生非离子代谢终产物（如乙醇），就无法通过改良培养基的配方来实现阻抗检测，限制了阻抗法在食品检测中的应用。针对这种情况，1989年Owen JD等提出间接阻抗法，即利用微生物生长代谢产生的二氧化碳导致碱性吸收溶液阻抗值的变化来实现微生物数目快速分析［20］，大大扩宽了阻抗法在食品微生物检测中的应用范围。间接阻抗法与之前的阻抗法不同之处在于：含碱性吸收液的测试管与含微生物的培养介质试管相通，含碱性吸收液吸收微生物生长代谢产生的二氧化碳，通过检测含碱性吸收液的测试管内的阻抗变化实现微生物快速分析，区别于直接阻抗法直接检测微生物培养介质的阻抗变化。Madden RH等分别用直接阻抗法和间接阻抗法检测食品中的沙门氏菌，得到间接阻抗法阳性结果的检出率比直接阻抗法高30%［21］。

除了阻抗法在微生物快速检测中的应用的研究外，也有一些研究人员专注于阻抗法检测过程中各阻抗成分变化及等效电路的研究。Hause LL等早在1981就指出两电极间的总阻抗值可分为培养介质电导和电极阻抗，并且在低频条件下微生物生长代谢引起阻抗虚部值的变化在总阻抗值的变化中占主导［22］。Felice CJ等认为阻抗测试管的阻抗成分可分为电极——培养介质界面阻抗和培养介质电导，而界面阻抗又包括界面电阻和双电层电容，整个等效电路由界面阻抗和培养介质电阻串联而成［23-24］。随着对阻抗法检测过程中阻抗成分变化研究的深入，研究人员开始研究不同阻抗成分（电导值、双电层电容值、总阻抗值）在微生物快速检测中的应用：Felice CJ等分别用双电层电容值、培养介质电导值作为阻抗检测参数检测牛奶中的菌落总数，得到双电层电容值在检测过程中的变化幅度更大，与平板计数法的相关性更好［25］；Flint SH等分别用电极阻抗、培养介质阻抗检测嗜热脂肪芽孢杆菌及其芽孢体的数目，发现只有电极阻抗值可用于这两种菌体形态数目的快速检测［26］。

在上述的阻抗法检测微生物的研究中，需要将被测食品样品加入到无菌培养介质中。为简化阻抗检测的操作，近年来，已有研究人员用检测电极直接检测被测样品的阻抗值来实现菌落总数的快速测定。其具体操作：检测电极直接浸入到被测样品中，记录阻抗变化，得到DT值，再由事先制得的标准曲线得到样品中的菌落总数。该操作不需要将被测样品加入到另外的无菌培养介质，比之前的阻抗检测法更易实现自动化，更符合食品工业的应用要求［27］。Grossi M等将金属电极直接插入冰激凌样品中进行阻抗检测，将得到的检出时间与样品中初始菌数做回归，得到回归方程：y=555.7-28.987lnx，R2= 0.7794，其中y的单位为min，x为菌落总数［28］。

2 阻抗法发展新趋势

2.1 微电极体系

微加工技术的发展，使得相互交叉微电极体系（IME，见图2）替代传统的检测电极开始应用于阻抗微生物检测中。IME跟普通检测电极类似，由阳极、阴极组成；但其阳极、阴极上带有多个指状电极，这些指状电极相互交叉，形成许多个电极对，每个电极对之间的距离通常在1～10μm，甚至能达到纳米级。IME的这种构造导致了通过电极的电流基本都分布在电极表面，这使得IME对电极表面的阻抗变化非常敏感；同时，因IME阴、阳极之间的距离很近，造成整个电极附近电场强度很大，使得IME的检测灵敏度很高［8，29］。Yang LJ用IME检测含微生物菌悬液中微生物数目，发现微生物数目在106～1010CFU/mL范围内跟阻抗值存在着线性关系，其R2高达0.98［30］。Yang LJ等、Varshney M等分别用IME检测食品中的沙门氏菌、病原性大肠杆菌，也都得到很好的检测结果［31-32］。

2.2 阻抗免疫传感器

阻抗免疫传感器利用IME对电极表面的阻抗变化高度敏感的优势，将阻抗法跟免疫学原理结合应用于食品中病原菌的快速检测。其具体操作：将对应于被测病原微生物的抗体采用特定的固定化技术固定在电极表面，利用抗原抗体免疫反应将被测微生物捕获，不同浓度的被测微生物其阻抗响应不同，据此实现病原菌的快速定性、定量分析［33-35］。目前，阻抗免疫传感器可用于检测食品中的致病性大肠杆菌、沙门氏菌、李斯特菌等［36-38］。Radke SA等用自制的阻抗生物传感器对含大肠杆菌的食品样品进行检测，得到该阻抗传感器可用于含104～107CFU/mL致病性大肠杆菌食品的快速检测［39］。Nandakumar V等，用自制的阻抗生物传感器检测食品中的沙门氏菌，结果表明该法可用于食品中沙门氏菌的快速检测［40］。

为了使阻抗免疫传感器的检测灵敏度更大，在制作阻抗免疫传感器过程中，除了将对应于被测病原菌的抗体固定在IME上，同时将一些标记物（如碱性磷酸酶）固定于IME上，用于增大阻抗微生物的检测过程中抗原——抗体免疫反应的响应信号［34］。

图2 相互交叉微电极

2.3 介电泳技术在阻抗检测中的应用

在阻抗检测过程中，除了阻抗法与免疫学原理的结合，介电泳技术也开始应用于阻抗检测。含被测微生物菌悬液在介电泳的作用下，依据其电学特性在检测管道内得到富集，然后再用IME进行阻抗检测［41-42］。Varshney M等用自制的检测装置检测牛肉中的病原性大肠杆菌，整个装置由流动池及检测池组成。在流动池内分布有带磁性的大肠杆菌抗体，样品注入该池，在介电泳的作用下被相应的抗体捕获，同时其余杂质则在介电力的作用下被洗脱，含大肠杆菌液体注入检测池内进行阻抗检测［43］。

3 结论

阻抗法是为数不多的可区分死菌、活菌的微生物检测方法，这对于食品安全具有重大意义。IME在阻抗检测中的应用，使得阻抗微生物检测越来越趋于微型化，同时大大提高了阻抗检测的灵敏度。免疫学原理与阻抗法的结合，解决了阻抗法在病原菌快速检测中应用的难题。介电泳技术在阻抗检测中的应用使得阻抗法在线检测食品中病原菌成为可能。

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Research progress in the impedance method in the detection of microorganisms in food

ZHANG Ai-ping，TANG Jia-ni，LIU Dong-hong*
（College of Biosystem Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China）

As a rapid detection method of microorganisms，the impedance method can be used to rapidly detect the total number of colonies，coliform，mold，yeast，and so on.There is great prospect for the rapid detection of pathogens in food as the research of the impedance method developed.The development of the traditional impedance method and the latest research of the impedance method were reviewed，aimed at the future research of the impedance method for rapid detection of microorganisms in food.

impedance；microorganism；development course；trend

TS201.3

A

1002-0306（2011）02-0436-04

2010-03-17 *通讯联系人

张爱萍（1985-），女，硕士研究生，主要从事微生物快速检测的研究。

十一五国家科技支撑项目（2006BD04A08）。