“酒精沼气双发酵耦联”工艺的探讨
——硫化物对木薯酒精发酵的影响*

姜立，张成明，张宏健，毛忠贵

1(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡，214122)2(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 ，214122)

“酒精沼气双发酵耦联”工艺的探讨
——硫化物对木薯酒精发酵的影响*

姜立1，2，张成明1，2，张宏健1，2，毛忠贵1，2

1(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡，214122)2(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 ，214122)

木薯酒精发酵时，采用“酒精沼气双发酵耦联”工艺会积累SO42－及其还原产物，对“双发酵耦联”工艺的顺利进行不利，为解决该问题，研究了硫酸盐、亚硫酸盐以及S2－对木薯酒精高浓发酵(料水比1∶2.2)的影响，结果表明，SO42－对木薯酒精发酵基本没有影响，而SO32－和S2－对木薯酒精发酵影响显著。在实验所添加的SO32－和S2－浓度范围内，随着硫化物浓度的增加，酒精产量逐渐降低，而副产物甘油产量逐渐升高;并且S2－的加入使发酵时间延长，当S2－浓度为6.0 mmol/L时，发酵时间延迟48 h。后两者均对乙醇发酵不利，应在双循环耦联工艺中去除。

硫酸盐，亚硫酸盐，S2－，木薯，酒精发酵，无废制造

以木薯生产燃料酒精，由于原料的非粮特性，近年来得到了较快发展。目前，国内的生产规模已接近200万t/年。然而，燃料酒精蒸馏废水污染问题始终是制约其可持续发展的瓶颈。通常的厌氧好氧法处理，经济上难以承受。蒸馏废液回用技术虽然取得了一定进展，但由于需要进行固液分离，且废液中又含有少量泥沙，造成分离装备的高维护成本，另外需对低pH的废液加碱调节，既增加了成本，又产生大量可溶性离子，对工艺长期运行不利。同时废液中酒精酵母发酵的副产物，如小分子有机酸、异戍醇、甘油等随着废液回用进入下一批发酵液，对酒精酵母的生长或发酵产生抑制作用［1］，使得蒸馏废液只能少量(25%左右)回用。

为解决困扰燃料酒精的废水污染问题，在总结前人经验及长期探索的基础上［2－5］，本实验室提出了“酒精沼气双发酵耦联”工艺(图1)。

图1 “酒精沼气双发酵耦联”工艺

该工艺借鉴生态系统中生物链的物质代谢关系，将酒精发酵阶段产生的蒸馏废液直接经过高温－中温两阶段厌氧处理，在降解纤维素半纤维素以及酵母代谢副产物的同时，产生沼气，实现全工艺零污染零能耗［6－9］。

该循环工艺中，由于厌氧出水pH一般在7.6～8.2中性略偏碱，酒精发酵工艺中需要添加H2SO4调节糖化和发酵pH到4.2～4.5，满足糖化酶的最佳作用pH，同时抑制杂菌生长(即所谓的“以酸制酸”技术)。但沼液中溶解了大量的CO2形成HCO3－缓冲体系，这种缓冲体系能保护厌氧反应器运行稳定而避免其酸化，却使得沼液作为工艺配料水调节pH时引入过量SO42－。SO42－在沼气发酵的还原态环境中被硫酸盐还原菌(SRB)逐步还原成SO2、H2S及其它中间价态硫化物，它们会对整个沼气发酵的微生物体系造成毒害作用，危害整个沼气部分的稳定性［10］，但是它们对酵母细胞的生长以及乙醇发酵的作用还不明了。由于一般工艺条件下，硫化物在燃料酒精生产过程中不会产生，因而未见文献报道。但是在“酒精沼气双发酵耦联”工艺中会出现，因而有必要深入研究这些硫化物对木薯酒精发酵的影响。文中通过实验分析了3种硫化物:SO42－、SO32－、S2－对木薯高浓酒精发酵的影响，以期完善“酒精沼气双发酵耦联”循环工艺。

1 材料与方法

1.1 材料

木薯:河南天冠企业集团有限公司提供。

菌种:安琪耐高温活性酿酒干酵母。

液体耐高温α－淀粉酶(20 000 U/mL)、液体糖化酶(130 000 U/mL)，无锡杰能科生物工程有限公司产品;其它试剂均为分析纯或优级纯的商品试剂。

种子培养基(g/L):葡萄糖20，酵母膏8.5，NH4Cl 1.3，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl20.06 ，pH 自然，0.08 MPa灭菌15 min。

1.2 实验方法

1.2.1 种子培养

接1环生长良好的斜面酵母至200 mL种子培养基中，28℃，100 r/min培养18 h。

1.2.2 液化

将木薯粉碎，过40目筛，称取适量，用蒸馏水调浆，拌匀后用2%H2SO4溶液调pH到6.0～6.4。按10 U/g木薯粉加入耐高温α－淀粉酶，于沸水浴中液化1 h。

1.2.3 同步糖化发酵

将1.2.2中得到的液化液冷却至60℃，用质量分数2%H2SO4调节料液pH至所需pH值，并按实验所需添加一定量的糖化酶，待料液冷却至30℃，接入10%酵母种子液，0.1% 尿素，于30℃ 恒温培养箱中静置发酵。

1.3 分析方法

糖化酶活力测定:按GB8276－1987测定。

酒精含量的测定:蒸馏法［11］、HPLC 法。

还原糖测定:斐林试剂法［11］。

总糖测定:样品用2%HCl于沸水浴中水解2 h，中和后按还原糖测定方法测定。

酵母数量的测定:血球计数法［12］。

甘油、葡萄糖含量的测定:高效液相色谱，色谱条件为:美国Dionex UltiMate 3000 HPLC，示差折光检测器日本 Shodex RI－101，紫外检测器 Dionex Ulti-Mate 3000，分析柱 Bio－Rad HPX－87 H离子交换柱，柱温60℃，流动相0.005 mmol/L稀 H2SO4，流速0.6 mL/min，进样量 20 μL。

2 实验结果与讨论

2.1 SO42－对木薯酒精发酵的影响

按照木薯粉与蒸馏水为1∶2.2的配比，液化调浆，分装。设定 Na2SO4加入浓度梯度为:0、7、14、21、28、35 mmol/L，该浓度是根据厌氧消化液回用时添加的H2SO4浓度来确定的。每个梯度取3个平行，进行同步糖化发酵。发酵过程中失重的变化如图2，其它各项数据见表1。

图2 浓度对酒精发酵过程中失重的影响

表1 浓度对酒精发酵性能的影响

表1 浓度对酒精发酵性能的影响

0 14.68 9.67 0.57 1.62 3.32 7 14.71 9.72 0.55 1.58 3.28 14 14.65 9.53 0.52 1.70 3.35 21 14.70 9.57 0.60 1.68 3.18 28 14.69 9.59 0.58 1.59 3.65 35 14.67 9.54 0.56 1.67 3.48

按照木薯粉与蒸馏水为1∶2.2的配比，液化调浆，分装，加入浓度梯度为:0、6、12、18、24、30 mmol/L的Na2SO3，该梯度由实验改进而来，每个梯度取3个平行，进行同步糖化发酵。发酵过程中失重的变化如图3所示，其它各项数据见表2。

图3 c［SO32－］对酒精发酵过程中失重的影响

表2 c［SO32－］对酒精发酵性能的影响

如图3所示，cSO32－浓度越大，木薯发酵培养基失重变化越快，与表2中酒精产量呈现相反的变化。这是由于在酵母发酵过程中，整个培养基体系的pH迅速下降到4.0左右，使反应向右移动，放出SO2气体。Na2SO3浓度越高，产生SO2气体越多，使得发酵体系失重表现出了与酒精产量不一致的现象。由对照和添加了亚硫酸溶液的样品之间的对比，可知添加Na2SO3对整个发酵体系产生了抑制作用。

如表2所示，SO32－越多，发酵结束乙醇浓度越低，甘油产量越多，残还原糖、残总糖浓度逐渐上升，酵母数呈现略微下降的趋势。甘油产量升高与酵母细胞自我保护密切相关［13－14］，SO32－导致酵母细胞生存条件恶化，在发酵过程中产生了更多的甘油维持内部环境稳定。并且由于SO2气体这种杀菌剂的产生，对酵母的生长代谢也起到了一定的抑制作用，当SO32－浓度为30mmol/L时，甘油产量高达 15.13 g/L，乙醇体积分数下降到了13.26%。

由图4电镜照片可以看出，在实验条件下添加的亚硫酸盐对酵母细胞形态几乎没有影响，酵母形态完整正常。故可以认为对酒精发酵的影响主要表现在代谢产生了更多的副产物甘油，使得最终酒精产量下降。

图4 发酵36 h酵母细胞电镜照片

综合上述结论可知，发酵体系中的SO32－对木薯酒精发酵是不利的，可以通过对厌氧沼液通入一定量的空气，使之完全氧化去除，消除其对发酵的不利影响。

2.3 S2－对高浓度木薯酒精发酵的影响

按照木薯粉与蒸馏水为1∶2.2的配比，液化调浆，分装，加入浓度梯度为:0、1.2、2.4、3.6、4.8、6.0 mmol/L的Na2S(浓度梯度为实验改进而来)，每个梯度取3个平行，进行同步糖化发酵。发酵过程中失重的变化如图5，其它各项数据见表4。

图5 cS2－对酒精发酵过程中失重的影响

表3 cS2－对酒精发酵性能的影响

如图5所示，S2－的添加浓度越大，对木薯高浓酒精发酵过程的抑制作用越明显，具体表现在对发酵的延迟上，当Na2S的浓度为6.0 mmol/L时，发酵体系的延迟期达到了48 h。但是当发酵启动后，几乎所有添加Na2S的组都能够在60 h内结束发酵，由此推知，Na2S对整个酒精发酵体系的影响主要来自对酵母生长的抑制上，对酒精发酵过程没有影响，同时发酵过程中不断有浓重的臭鸡蛋味道放出，可以推知，随着发酵液pH的下降，在酸性条件下发生反应:

H2S是公认的毒性气体，它的存在严重影响了酵母的生长，随着H2S浓度的增大，酵母在发酵的过程中产生了更多的甘油来抵御毒害。

如表3所示，随着Na2S添加浓度的增大，发酵培养基中的最终甘油产量逐渐增加，酒精产量逐渐减少，残总糖含量逐渐增大。当S2－的浓度为6 mmol/L时影响最为显著，发酵时间延迟到了48 h，发酵结束最终乙醇体积分数为13.20%，比对照(14.68%)低了10% ，甘油产量为15.00 g/L比对照(9.67g/L)高了55.12%。

由图6电镜照片可以看出，当Na2S的添加浓度较低(2.4 mmol/L)时，酵母细胞的形态都非常完整，并没有发生变化或是破裂，所以能够在较短的时间内恢复并且正常发酵。当Na2S的添加浓度较大时(6.0 mmol/L)，发酵36 h部分酵母细胞破裂，极少酵母细胞出芽生殖。后期可能是由于H2S气体的大量释放，使得体系中的S2－浓度下降，少数存活的酵母细胞继续繁殖，使得发酵能够维持。如果Na2S浓度继续增大，那么可能将维持酵母细胞继续生长的活力完全消除，发酵将会被完全抑制。

图6 发酵36 h酵母细胞电镜照片

由实验结果可知，S2－的存在对乙醇发酵的抑制和毒害作用非常明显，主要表现在对酵母的伤害上。必须在发酵之前去除，可以考虑在“资源化”过程中加入少量的过氧化氢去除，否则不利于乙醇发酵的顺利进行。

3 讨论

不同的硫化物对木薯酒精发酵(料水比1∶2.2)的影响有明显差异。S对木薯酒精发酵几乎没有影响，对酒精发酵有一定的影响，当浓度为30 mmol/L时，乙醇体积分数仅为 13.26%，甘油产量高达15.13 g/L。S2－对酒精发酵的影响非常显著，当的浓度为6 mmol/L时，发酵时间延迟到了48 h。

SO2和H2S及其他中间价态硫化物会危害到整个产沼气体系的稳定性。本实验证明硫酸盐还原产物SO32－及S2－会影响酒精发酵，不利于木薯乙醇发酵，因此在整个循环工艺中应尽量消除。文中提到的消除这2种对发酵产生不利影响的硫化物的方法仅作为一种暂时的处理手段。在后续实验中会不断改进“资源化”手段，使“酒精沼液双发酵耦联”工艺能够得到更好的应用。

［1］ Moon，Nancy J.Inhibition of the growth of acid tolerant yeasts by acetate，lactate and propionate and their synergistic mixtures［J］.Journal of Applied Bacteriology，1983，55:453－460.

［2］ Wojciech Bialas，Daria Szymanowska，Wlodzimierz Grajek.Fuel ethanol production from granular corn starch using Saccharomyces cerevisiae in a long term repeated SSF process with full stillage recycling［J］.Bioresource Technology，2010，101(9):3 126 －3 131.

［3］ 赵江，赵华.酒糟滤液全回用技术在酒精发酵上的应用［J］.食品研究与开发，2008，29(06):75 －78.

［4］ Ding Zhong－ yang，Zhang Ling，Fang Ya－ ye ，et al.Application of full permeate recycling to very high gravity ethanol fermentation from corn［J］.Korean J Chem Eng，2009，26(3):719 －723.

［5］ 毛忠贵，张建华.燃料乙醇制造的“零能耗零污染”趋势［J］.生物工程学报，2008，24(6):946 －949.

［6］ 张静，翟芳芳，张建华，等.酒精沼气双发酵偶联中厌氧沼气的发酵行为［J］.食品与生物技术学报，2010，29(2):276－281.

［7］ Zhang Cheng－ming，Mao Zhong－gui.Effective ethanol production by reutilizing waste distillage anaerobic digestion effluent in an integrated fermentation process coupled with both ethanol an methane fermentation［J］.Bioprocess Biosyst Eng，2010，33(9):1067 －1075.

［8］ Sun Fu－bao，Mao Zhong－gui，Tang Lei，et al.Explo-ration of water－recycled cassava bioethanol production integrated with anaerobic digestion treatment［J］.African Joumal of Biotechnology，2010，9(37):6 182－6 190.

［9］ Sun Fu－bao，Mao Zhong－gui，Zhang Jian－hua，et al.Water － recycled Cassava Bioethanol Production Integrated with Two － stage UASB Treatment［J］.Chinese Journal of Chemical Engineering，2010，18(5):837－842.

［10］ 郑新，闵航.亚硫酸盐、硫化物对厌氧消化的影响［J］.环境污染与防治，1995，17(4):1 －4.

［11］ 蔡定域，酿酒工业分析手册［M］.北京:轻工业出版社，1988:50－64.

［12］ 诸葛健，王正祥，工业微生物实验技术手册［M］.北京:中国轻工业出版社，1994，220－223.

［13］ Carine Bideaux ，Sandrine Alfenore，Xavier Cameleyre，et al，Minimization of Glycerol Production during the High-Performance Fed-Batch Ethanolic Fermentation Process in Saccharomyces cerevisiae，using a Metabolic Model as a Prediction［J］.Applied and Environmental Microbiology，2006，72(3):21 －34.

［14］ 党卫红.亚硫酸盐的毒性作用［J］ .河南预防医学杂志，2008，19(4):318 －320.

The Improvement of Ethanol － methane Coupled Process—The Effect of Sulfides on Ethanol Fermentation in Cassava mashes

Jiang li1，2，Zhang Cheng-ming1，2，Zhang Hong-jian1，2，Mao Zhong-gui1，2
1(Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)2(School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

The sulphate and its reduction products could be accumulated in Dual Coupling of Ethanol and Methane Fermentation Process which do harm to the whole process.The effect of three sulfides including sulphate sulfite and sulfion on ethanol fermentation of very high gravity cassava mashes(the ratio of cassava and water to 1∶2.2(w/w)was researched in this article.The final results showed that sulfite and sulfion had great influence on ethanol fermentation，but sulphate had not.With the sulfite and sulfion concentration increased under the experiments concentration，the yield of ethanol decreased and the byprocuct glycerol increased.The lag phase delayed when the fermentation mashes added with sulfion .It delayed to 48h when the sulfion concentration was 6.0 mmol/L.Both of the two sulfides that harmed ethanol fermentation needed to be eliminated during the dual coupling fermentation.

sulphate，sulfite，sulfion，cassava，ethanol fermentation，cleaner production

硕士(毛忠贵教授为通讯作者)。

*“十一五”国家863计划导向项目(2008AA10Z338)

2011－04－21，改回日期:2011－06－23