不同黄酒部位的沉淀蛋白质氨基酸组成分析*

黄雪松，陈磊

(暨南大学食品科学与工程系，广东广州，510632)

不同黄酒部位的沉淀蛋白质氨基酸组成分析*

黄雪松，陈磊

(暨南大学食品科学与工程系，广东广州，510632)

为分析黄酒混浊与沉淀的原因，采用硅溶胶吸附分离法获得黄酒酒液和酒脚中易引起沉淀的蛋白，并一起分析测定这2个样品和酒脚的氨基酸组成。结果表明:酒液沉淀蛋白的主要氨基酸为谷氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸，相对含量分别为41.33%、18.66%和9.56%;酒脚沉淀蛋白中主要氨基酸为谷氨酸、天门冬氨酸、亮氨酸，分别为12.39%、11.32%和8.02%;酒脚中主要氨基酸为谷氨酸、天门冬氨酸、亮氨酸，分别为16.57%、10.91%、7.14%。该结果显示黄酒所含醇溶蛋白质中的谷氨酸导致黄酒混浊、沉淀现象的主要氨基酸。

黄酒，沉淀，蛋白，氨基酸

黄酒(Chinese rice wine)，酿造历史悠久，营养丰富、滋味独特 ，被誉为“国酒”，但在货架期内存在着失光、混浊、沉淀等现象。这些沉淀虽然对人体无害，但严重影响黄酒的外观品质。人们对于黄酒中的混浊沉淀成分及其形成机理进行了大量探索，不仅对其中的蛋白质含量和分子量进行了测定［1－3］，还对其他共存物如糖、多酚、金属离子以及它们在酒液和酒脚(即黄酒沉淀物)含量的变化等进行了大量研究［4－5］。除明确的草酸钙沉淀外［6］，到目前仍无确定结论说明黄酒中沉淀的成因及其主要影响因素。因此，尽管相关学者和很多黄酒生产技术人员对黄酒的澄清做了大量尝试［7－8］，混浊沉淀问题仍未得到有效解决，这可能与至今未能确定组成沉淀蛋白质的种类及其相关的理化性质有关。但获得各种高纯度的黄酒混浊、沉淀蛋白质，并研究其理化性质、进而揭示其混浊、沉淀机理，这是一项系统、复杂、繁重的任务。本文对黄酒沉淀蛋白进行提取分离，测定其总的氨基酸组成，为黄酒蛋白沉淀机理研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器和设备

黄酒购自浙江某上市公司(50kg坛装，1年期)。硅溶胶，(NH4)2SO4，氨水，NH4HCO3。

红外吸收光谱仪(EQUINOX 55)，德国Bruker公司，氨基酸分析仪(Hitachi)，日本日立公司;气相色谱质谱联用仪(Shimadzu QP2010)，日本;LC－20AT高效液相色谱仪(Shimadzu)，日本;光电二极管阵列检测器(SPD－M20A，Shimadzu)，日本;色谱工作站(Class－vp;紫外可见分光光度计(SC－53)，上海棱光技术有限公司;旋转蒸发器(RE－52 AAB)，上海嘉鹏科技有限公司;FD－1冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司;KDC－1044低速离心机，科大创新股份有限公司中佳分公。

1.2 沉淀蛋白样品的制备

1.2.1 酒液沉淀蛋白(样品A)

将25 L的黄酒开坛后取20 L按4 mL/L的比例加入酸性硅溶胶，反复振荡摇匀，放置24 h待其沉降完全，收集沉淀物，用蒸馏水将沉降物反复水洗3次除去酒精;以2%的氨水溶解沉降物，然后用25%饱和度的(NH4)2SO4盐析，4℃过夜，待盐析完全，于3 800 r/min离心10 min，用25%饱和度的(NH4)2SO4洗涤3次，于相同条件下离心，取沉淀;将沉淀用3 000 u的透析袋于4℃透析24 h脱盐，脱盐后的样品在－80℃冷冻24 h后于真空冷冻干燥机中冻干得1.206 g样品，此即为样品A。

1.2.2 酒脚沉淀蛋白(样品B)和酒脚(样品C)

开坛得到的酒脚以3 800 r/min离心20 min，将沉淀用蒸馏水洗3次，相同条件离心取沉淀，平均分为2部分，其中1份以2%的氨水溶解，然后用25%饱和度的(NH4)2SO4盐析，4℃12 h，待盐析完全，于3 800 r/min离心10 min，用25%的(NH4)2SO4洗涤3次，于相同条件下离心，取沉淀;将沉淀用3000 u的透析袋于4℃透析24 h脱盐，脱盐后的样品在－80℃冷冻24 h后于真空冷冻干燥机中冻干得2.502 g样品，此为样品B;另1份直接冷冻干燥，得25.387 g样品，此为样品C。

水解氨基酸的测定。(1)水解:准确称取10.0～20.0 mg样品放于水解管中，在水解管内加入10.0 mL浓度6 mol/L的HCl，加入新蒸馏的苯酚3～4滴，再将水解管放入冷冻剂中，冷冻3～5 min，再抽真空(接近0 Pa)，然后充入高纯氮气;再抽真空充氮气，重复3次后，在充氮气状态下封口，并将其放在(110±1)℃的恒温干燥箱内，水解22 h，取出冷却。打开水解管，将水解液过滤后，用去离子水多次冲洗水解管，将水解液全部转移到50 mL容量瓶内，用去离子水定容。吸取滤液1 mL于5 mL容量瓶内，用真空干燥器在40～50℃干燥，残留物用1～2 mL去离子水溶解，再干燥，反复进行两次，最后蒸干，用1 mL pH 2.2的缓冲液溶解，供仪器测定用。(2)测定:准确吸取0.200 mL混合氨基酸标准，用pH 2.2的缓冲液稀释到5 mL，此标准稀释液浓度为100 μmol/L，作为上机测定用的氨基酸标准，用氨基酸自动分析仪以茚三酮柱后衍生法分别在570 nm和440 nm测定试样中氨基酸含量，色谱柱为日立855－350型，柱温57℃，反应柱温134℃，进样量20 μL，测定时间59 min。以外标单点矫正法定量试样测定液中的氨基酸。

2 结果与分析

2.1 标准氨基酸分析

图1显示了混合氨基酸标准溶液分离效果，由图1a可看出570 nm下16种氨基酸分离效果良好，而在440 nm下，脯氨酸的分离效果也较为理想(图1b)，可以满足分离、定量的要求。

图1 标准氨基酸分离图谱

2.2 样品中氨基酸的分析

由图2可以看出，3个样品的水解液中氨基酸的分离效果良好。

图2 样品中氨基酸分离图谱

计算样品中氨基酸含量后发现(表1)，酒液沉淀蛋白(A)中水解氨基酸总含量最低，仅为5.493%，这说明硅胶从酒液中所吸附下来的成分中，其蛋白并不是主要成分;通过碱溶盐析所得的酒脚沉淀蛋白(B)中水解氨基酸总含量最高，为43.665%;酒脚(C)中水解氨基酸总含量为28.095%;由于酒脚样品未经其他处理，且易吸潮，可推断其中含有一定量的糖类部分。同时，由图2可看出，3个样品中均含有较高量的NH3，其主要来源为样品的水解，这也是造成所测样品中蛋白含量较低的原因之一。

表1 三个样品中水解氨基酸的种类及含量

通过比较3个样品中水解氨基酸的相对含量(图3)可知，酒液沉淀蛋白(A)中的主要氨基酸为谷氨酸，占其氨基酸总量的41.33%，其次为脯氨酸和苯丙氨酸，分别占18.66%和9.56%;酒脚沉淀蛋白(B)中含量最高的为谷氨酸(12.39%)，其次是天门冬氨酸(11.32%)和亮氨酸(8.02%);酒脚(C)中含量最高的也是谷氨酸(16.57%)，然后是天门冬氨酸(10.91%)和亮氨酸(7.14%)。总之，3个样品中，谷氨酸的含量是最高的，这意味着黄酒蛋白中的谷氨酸可能对黄酒的混浊与沉淀有重要影响。

图3 三个样品中水解氨基酸的相对含量

谷氨酸在黄酒主要原料小麦所含蛋白质，即清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白中的含量分别为:16%，16.0%，32.4%，22.7%［8］，即醇溶蛋白中的谷氨酸含量最高。与样品A中谷氨酸含量(41.33%)相比稍低，但据此仍然可以认为:样品A主要含有醇蛋白，即引起黄酒混浊沉淀的蛋白质主要为酸性的醇溶蛋白。至于两个谷氨酸含量的差异，估计与醇溶蛋白的亲水部分被水解有关。

黄酒混浊、沉淀蛋白质与啤酒沉淀蛋白不同，黄酒沉淀蛋白质主要含有谷氨酸，而啤酒沉淀蛋白主要含有脯氨酸［10－12］，这表明引起黄酒中的沉淀原因和机理与啤酒不同。啤酒沉淀(与混浊)蛋白水解物中的脯氨酸含量是最高的，人们据此认为蛋白多酚沉淀主要是脯氨酸与多酚之间的结合造成的。而黄酒沉淀蛋白主要与其所含醇溶蛋白有关。

根据本文与有关文献实验数据分析认为:醇溶蛋白是引起黄酒混浊沉淀的，这一结论与实际情况也是一致的。例如随着贮存时间的延长，pH值常常下降，这样会引起主要由酸性氨基酸组成的醇溶蛋白疏水性的增强，因而导致沉淀现象发生;另外，当贮存温度降低时，醇溶蛋白在黄酒中的溶解度也是降低的，也会引起黄酒的混浊沉淀现象。至于其详细的混浊、沉淀机制，还有待进一步研究。

［1］ 杨国军，俞关松，尉冬青.黄酒中蛋白质分布、含量与酒质稳定性的研究［J］.酿酒科技，2005(7):68－70.

［2］ 陈云萍，熊建生.黄酒稳定性技术的研究［J］.食品与发酵工业，1989(2):11－16.

［3］ 谢广发，孟中法，周建弟.黄酒蛋白质的测定及其沉淀原因探讨［J］.酿酒科技，2002(3):64－68.

［4］ 林峰，白少勇，邹慧君，等.黄酒蛋白质沉淀［J］.酿酒科技.2005(9):69－72.

［5］ 江超，林峰，邹慧君等.陈年绍兴黄酒的成分分析与品质鉴定［J］.食品与发酵工业，2009，35(10):119－123.

［6］ 谢广发，沈斌，胡志明等.黄酒中的另一种沉淀——草酸钙沉淀［J］.酿酒，2011，38(3):26－28.

［7］ 魏桃英，寿泉洪，唐国芳.谈黄酒的非生物性浑浊和沉淀［J］.酿酒，2009，36(34):56 －57.

［8］ 贾俊强，马海乐，骆琳，等.脱脂小麦胚芽蛋白分类及其氨基酸组成分析［J］.中国粮油学报，2009，24(2):40－45.

［9］ 杨国军.澄清剂在预防黄酒非生物混浊中的应用［J］.山东食品发酵，2005(1):23－25.

［10］ 李磊译.硅凝胶去除啤酒中形成的浑浊蛋白质［J］.食品与机械，1992(3):42.

［11］ Asnao K，Hashimoto N.Characterization of haze－forming proteins of beer and their rolesin chill haze formation［J］.J Am Soc Brew Chem，1982(40):147 －154.

［12］ Nummin M，Loisa M Enari，T M.Fractionation of hazeforming compounds in beer［J］.Proc Congr Eui Brew Conv，1969(12):349 －356.

Components of Amino Acids of Haze Protein from the Different Setting Fraction in Chinese Rice Wine

Huang Xue-song，Cheng Lei
(Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China)

To investigate the causes of turbidity and sedimentation in Chinese rice wine，haze proteins were obtained through the absorbing effects in the rice wine and precipitate.The hydrolysis amino acids of both the haze proteins and the precipitate were analyzed by amino acid auto－analyzer.The results show that the haze protein in rice wine is composed mainly of glutamic(41.33%)，proline(18.66%)and phenylalanine(9.56%)，haze protein in the precipitate is composed of luctamic(12.39%)，aspartic(11.32%)and leucine(8.02%)and those in the precipitate is composed of glutamic(16.57%)，aspartic(10.91%)and leucine(7.14%).A conclusion can be drawn that glutamic acid is the main amino acid of haze proteins that caused the turbidity and sedimentation of rice wine.Key words rice wine，precipitate，haze protein，amino acid

博士，教授。

*广东省产学研科技项目(2011B0980400452)资助

2011－03－19，改回日期:2011－09－01