增强毛霉菌的细胞通透性对腺嘌呤合成ATP的影响

朱家荣，杨光辉，杨善岩，裘娟萍

(浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江 杭州，310032)

增强毛霉菌的细胞通透性对腺嘌呤合成ATP的影响

朱家荣，杨光辉，杨善岩，裘娟萍

(浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江 杭州，310032)

采用雅致放射毛霉转化腺嘌呤合成ATP，系统地研究了菌体通透化方法，考察了它对腺嘌呤转化率、ATP产量的影响，筛选出较佳方法，并采用电导率法验证菌体通透性的改变情况。结果表明，通过干燥方法处理毛霉菌体，在含有3 g/L腺嘌呤的反应液中，转化生成10.13 g/L ATP，腺嘌呤转化率为82.76%，比对照组提高202.39%;干燥处理后的毛霉菌体的电导率显著提高，且电导率随干燥时间的变化趋势与ATP产量随干燥时间的变化趋势基本吻合，表明干燥方法真实地提高了毛霉菌的通透性，进而提高了腺嘌呤转化率及ATP产量。

干燥法，有机溶剂，表面活性剂，电导率

细胞膜控制着细胞外物质的进入和细胞内代谢产物的排出，一般相对分子质量较小的物质如葡萄糖、Na+等通过渗透作用或主动运输通过细胞膜，但某些相对分子质量较大的物质如ATP不能通过细胞膜［1］。因此在生物合成过程中，提高菌体细胞膜的通透性不仅有利于底物吸收和产物排泄，还有利于降低胞内产物浓度，减少或解除产物反馈调节，从而提高产物产量。

细胞通透化处理即改善细胞膜的通透性，可以有效解除其渗透障碍，通透化细胞通常仍保持形态完整性，但由于细胞膜受到破坏，其对高分子量物质的渗透障碍被部分或完全解除［2］。细胞膜通透化方法分为物理方法和化学方法，物理方法包括空气干燥［3］、渗透压冲击［4］、温度冲击［5］、电处理［6－8］、超声波处理［9－10］等，物理方法无毒，环保，但在生产操作上有一定的难度。化学方法则是通过添加化学物质改善菌体细胞膜的通透性，促进细胞外底物的摄入及细胞内代谢产物的排出，根据添加剂的种类分为有机溶剂法、表面活性剂法等。有机溶剂法常用甲苯［11］、二甲基亚砜(DMSO)［12］、异丙醇［13］等，与有机溶剂法相比，表面活性剂法［14］毒性较低，用以提高菌体通透性有一定的优势。化学方法操作简便，但是一定程度上受到环保、安全的限制。

ATP是生物细胞生命活动能量的直接来源，临床上广泛用作细胞激活剂［15］，近期ATP的促进细胞坏死和凋亡［16］、抗癌［17］等作用受到关注。目前国内外主要采用生物法生产ATP，而采用雅致放射毛霉转化腺嘌呤合成ATP的工艺尚未见诸报道。毛霉菌具有丰富的酶系，采用毛霉菌生物合成ATP具有菌体易培养、生长速度快、便于分离收集等优点，但是该工艺存在腺嘌呤转化率、ATP产量较低等问题，而改善毛霉菌细胞膜的通透性是提高腺嘌呤转化率及ATP产量的重要途径。目前毛霉菌的通透性对ATP生产活性的影响未见系统研究报道，本文以雅致放射毛霉为菌种，较系统地研究毛霉菌通透化方法，以期获得较佳的提高菌体通透性方法，为生物法高效合成ATP提供参考。

1 材料与方法

1.1 药品与仪器

腺嘌呤(上海化学试剂公司，质量分数≥98.0%，文中使用量未扣除杂质);其他试剂均为化学纯或生化试剂。

SCR－3型稳流稳压电泳仪，江苏丹阳无线电一厂;紫外分析仪，上海科艺光学仪器厂;Gold Spectru mlab 54紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司;CV－33超声波细胞破碎仪，Sonics＆Materials，Inc.;数显恒温水浴锅，上海申胜生物技术有限公司;TGL 16M高速离心机，长沙湘智离心机仪器仪表有限公司;DDSJ－308A型电导率仪，上海精密科学仪器有限公司－雷磁仪器厂。

1.2 菌种

雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)。

1.3 培养基

斜面种子培养基(g/L):葡萄糖 20，蛋白胨 10，酵母膏 5，NaCl 5，琼脂 2，pH 6.0 ～6.5。

摇瓶种子培养基(g/L):葡萄糖20，蛋白胨 10，酵母膏 5，NaCl 5，pH 6.0 ～6.5。

菌体培养基(g/L):葡萄糖40，酵母膏3，玉米浆10，MgSO4·7H2O 1，FeSO4·7H2O 0.2，NH4Cl 3，K2HPO4·3H2O 3，pH 6.0 ～6.5。

1.4 菌体培养及收集

将活化后的斜面菌种制成孢子悬浮液，以10%(V/V)的接种量接入100 mL摇瓶种子培养基中，置于28℃，160 r/min旋转式摇床中培养12 h。以10%(V/V)的接种量将上述种子液接入300 mL菌体培养基中，置于28℃，160 r/min旋转式摇床中培养12 h。

发酵结束，过滤收集菌体，用0.9%(W/V)生理盐水洗涤3次，挤干水分至菌体恒重，作为转化合成ATP的菌体。

1.5 转化反应

1.5.1 反应液(g/L)

葡萄糖 90，Na2HPO4·12H2O 90，MgCl2·6H2O 4，腺嘌呤3，毛霉菌体400。

1.5.2 反应方法

称取毛霉菌体，加入反应液中，搅拌均匀，置于33℃，160 r/min旋转式摇床中，转化反应6 h后，每隔2 h用纸电泳法检测转化反应情况［18－19］。

1.6 产物分析及计算

取样5 μL，点样在20 mm宽的普通滤纸上，以pH 2.5柠檬酸－柠檬酸钠溶液(C6H8O7·H2O 9 g/L，C6H5Na3O7·2H2O 1 g/L)为缓冲液，电压梯度为400 V，电泳45 min。电泳结束后，用吹风机吹干滤纸，在紫外分析仪下划出与标准ATP斑点相同位置的产物斑点，将斑点剪成2 mm左右的细条，用5 mL 0.01 mol/L HCl于28℃，160 r/min旋转式摇床中浸提4 h，测定浸提液在260 nm波长下的吸光度(OD260)。

式中:MrATP为ATP的相对分子质量;C为稀释倍数(浸提液体积/样品点样体积);EATP为ATP摩尔吸光系数［1.43×104L/(mol·cm)］。转化率(%)，即摩尔转化率，数值等于实际ATP产量与理论ATP产量之比。

1.7 物理方法的筛选

干燥方法［3］:称取毛霉菌体，将菌体撕成薄片，均匀地散布于培养皿中，用吹风机吹至恒重，用于转化反应。

超声波方法［23］:称取毛霉菌体，均匀地悬浮于反应液中，置于冰水浴中，用超声波间隙短时处理，用于转化反应。超声作用参数:频率为20 kHz，功率为500 W，超声的作用时间为每次3 s，间隔时间为4 s，作用的总时间为900 s。

冷冻方法［5］:称取毛霉菌体，将菌体撕成薄片，均匀地散布于培养皿中，置于－20℃冰箱中冷冻处理24 h，用于转化反应。

水浴加热法:称取毛霉菌体，均匀地悬浮于反应液中，置于60℃恒温水浴锅中处理2 h，用于转化反应。

电处理方法［6－8］:电处理具体参数为:电压 20 V，功率1 W，摇瓶容积100 mL，铂电极直径0.5 mm，电极间距5 cm，电极浸入液面下1 cm。菌体通透化操作过程为:称取毛霉菌体，均匀地悬浮于反应液中，施加50 mA直流电处理2 h，用于转化反应。

1.8 化学方法的筛选

1.8.1 有机溶剂法的筛选

有机溶剂的种类:二甲苯、甲苯、戊二醛、三氯甲烷、丙烯酸、丙酮。

1.8.2 表面活性剂法的筛选

表面活性剂的种类:新洁尔灭、吐温60、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、溴化十六烷吡啶、椰子油脂肪酸二乙醇酰胺(6501)、D-山梨醇、十二烷基苯磺酸钠、硬脂酸、硬脂酸单甘油酯、咪唑、十二烷基磺酸钠(SDS)。

1.9 电导率法考察菌体通透性

采用电导率法考察菌体细胞膜的通透性［24］。DDSJ－308A型电导率仪的相关参数:电极为DJS－1C型电导电极(铂黑)，电极常数为1.0 cm－1，测量范围为20.0～19.9 mS/cm。

1.9.1 干燥处理后菌体通透性的测定

过滤收集菌体，首先将菌体用超纯水洗涤3次，挤干水分至菌体恒重，称取3 g菌体，置于65℃烘箱中干燥处理180 min，取出称重，然后悬浮于30 mL超纯水中，菌体因干燥损失的水分用超纯水补足，再置于28℃，160 r/min旋转式摇床中恒温振荡2 h，最后将菌体悬浮液离心(8 000 r/min，15 min)，上清液用于测定电导率。

1.9.2 二甲苯处理后菌体通透性的测定

过滤收集菌体，首先将菌体用超纯水洗涤3次，挤干水分至菌体恒重，称取3 g菌体，悬浮于30 mL超纯水中，然后加入1%的二甲苯，摇匀，再置于28℃，160 r/min旋转式摇床中恒温振荡2 h，最后将菌体悬浮液离心(8000 r/min，15 min)，上清液用于测定电导率。

1.9.3 溴化十六烷吡啶处理后菌体通透性的测定

过滤收集菌体，首先将菌体用超纯水洗涤3次，挤干水分至菌体恒重，称取3 g菌体，悬浮于30 mL超纯水中，然后加入0.2%的溴化十六烷吡啶，摇匀，再置于28℃，160 r/min旋转式摇床中恒温振荡2 h，最后将菌体悬浮液离心(8000 r/min，15 min)，上清液用于测定电导率。

2 结果与分析

2.1 物理方法的筛选及优化

以物理方法处理菌体，会对细胞壁和细胞膜产生结构性破坏，从而提高菌体的通透性［3］。采用干燥法、超声波法、冷冻法、水浴加热法、电处理方法处理毛霉菌体，反应后测定腺嘌呤转化率及ATP产量，以未经处理的毛霉菌体为对照，筛选物理通透化方法，结果见表1。冷冻方法对转化反应无促进作用，且工业生产中的可操作性差;超声波方法的可操作性较差;水浴加热方法、电处理方法的可操作性较佳，但经过优化发现对转化反应的促进作用不显著;干燥方法可以显著提高腺嘌呤转化率及ATP产量，且工业生产中具有较佳的可操作性，故选取干燥方法进行优化研究。

表1 各种物理方法对转化反应的影响

2.1.1 干燥温度的优化

称取毛霉菌体，将菌体撕成薄片，均匀地散布于培养皿中，分别置于 30，40，50，60，65，70，80 ℃ 烘箱中烘干至恒重，用于转化反应，以确定干燥温度，结果见图1。当干燥温度为65℃时，腺嘌呤转化率、ATP产量较高。

2.1.2 干燥时间的优化

称取毛霉菌体，将菌体撕成薄片，均匀地散布于培养皿中，分别置于65℃烘箱中持续烘干30，60，90，120，150，180，210，240 min，用于转化反应，以确定较佳的干燥时间，结果见图2。当干燥时间为180 min时，腺嘌呤转化率、ATP产量较高，分别为82.76%、10.13 g/L，比对照组提高202.39% 。

2.2 化学方法的筛选及优化

2.2.1 有机溶剂的筛选

图2 干燥时间对转化反应的影响

有机溶剂可以透过菌体细胞膜的脂质体，通过内反应破坏细胞膜的结构和脂质体的流动性，使细胞膜失去原有的传递细胞内外物质的调控能力，从而提高菌体的通透性［3］。向反应液中分别加入不同的有机溶剂，每种有机溶剂的加量分为0.1%，0.5%，1%，搅拌均匀，置于33℃，160 r/min的摇床中转化，反应后测定腺嘌呤转化率及ATP产量，以原始反应液为空白对照，筛选较佳的有机溶剂，结果见表2。二甲苯、甲苯、三氯甲烷、戊二醛对转化反应均有不同程度的促进作用，其中二甲苯的促进作用较显著，故选择二甲苯，对其用量进行进一步的优化。

表2 各种有机溶剂对转化反应的影响

2.2.2 二甲苯用量的优化

向反应液中分别加入 0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%的二甲苯，反应后测定腺嘌呤转化率及ATP产量，结果见图3。当二甲苯的用量为1.0%时，腺嘌呤转化率、ATP产量较高，为62.17%，7.61 g/L，比对照组提高130.61%。二甲苯有毒，并有一定的致癌性，工业生产上应尽量减少其用量。

图3 二甲苯用量对转化反应的影响

2.2.3 表面活性剂的筛选

表面活性剂是具有固定的亲水亲油基团，可以在溶液的表面定向排列，而且可使溶液的表面张力显著下降的物质，因毒性相对较低，用以提高菌体通透性有一定的优势。向反应液中分别加入不同表面活性剂，每种表面活性剂的加量分为 0.1%，0.5%，0.1%，搅拌均匀，置于33℃，160 r/min的摇床中转化，反应后测定腺嘌呤转化率及ATP产量，以原始反应液为空白对照，筛选较佳的表面活性剂，结果见表3。新洁尔灭、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、溴化十六烷吡啶、椰子油脂肪酸二乙醇酰胺(6501)、十二烷基苯磺酸钠、硬脂酸单甘油酯对转化反应对转化反应均有不同程度的促进作用，其中溴化十六烷吡啶的促进作用较显著，故选择溴化十六烷吡啶，对其用量进行进一步优化。

表3 各种表面活性剂对转化反应的影响

2.2.4 溴化十六烷吡啶用量的优化

向反应液中分别加入 0.1%，0.2%，0.3%，0.5%，0.8%，1.0%的溴化十六烷吡啶，反应后测定腺嘌呤转化率及ATP产量，结果见图4，当溴化十六烷吡啶用量为0.2%时，腺嘌呤转化率、ATP产量最大，分别为 47.47%、5.81 g/L，比对照组提高81.56%，继续增加溴化十六烷吡啶的用量，腺嘌呤转化率、ATP产量迅速下降，故溴化十六烷吡啶用量以0.2%为宜。

图4 溴化十六烷吡啶用量对转化反应的影响

2.3 电导率法考察菌体通透性

细胞膜是活细胞和外界环境之间的屏障，外界环境破坏细胞膜结构，细胞内的物质外渗，尤其是电解质的外渗，会引起外界环境的电导值增加，因此菌体细胞膜的通透性可以用电导率法来考察［24］。

对于上述通透化方法中ATP产量较高的干燥、二甲苯、溴化十六烷吡啶3种通透化方法，分别采用电导率法考察验证其菌体通透性改变情况。按方法1.9考察3种通透化方法处理的菌体细胞膜通透性，结果见表3和图5。由表3可见，通透化处理组的电导率明显大于未通透化处理的对照组，由图5可见，电导率随干燥时间的变化趋势与ATP产量随干燥时间的变化趋势基本吻合，证明分别单独采用干燥、添加二甲苯或溴化十六烷吡啶的通透化方法，均真实地提高了毛霉菌细胞膜的通透性，进而提高了腺嘌呤转化率及ATP产量。

表3 三种处理方法对菌体通透性的影响

图5 干燥时间对电导率及ATP产量的影响

3 结论

(1)分别单独采用干燥方法、二甲苯、溴化十六烷吡啶处理毛霉菌体均可显著提高菌体通透性、腺嘌呤转化率及ATP产量，干燥方法效果最佳，在含有3 g/L腺嘌呤的反应液中，转化合成10.13 g/L ATP，腺嘌呤转化率为82.76%，比对照组提高202.39%。

(2)二甲苯可以显著提高ATP产量，但二甲苯毒性强、用量大，制约了其在工业生产上的应用;溴化十六烷吡啶对ATP合成的促进作用虽不如干燥方法或二甲苯，但其毒性低、用量少、操作简便，亦具有一定的应用价值。干燥方法与添加二甲苯或溴化十六烷吡啶相比，操作过程比较繁琐，但是干燥方法更加高效，无毒，环保，且利于ATP的分离提取，实验中发现添加二甲苯或溴化十六烷吡啶，转化反应时间只能维持10～12 h，超过12 h，ATP开始分解，ATP产量显著降低，而干燥方法处理菌体，反应时间可适当延长，推测干燥方法对菌体内相关酶的破坏程度相对较低，使反应过程中相关酶活力更加稳定。

(3)目前国内外关于ATP的研究多是采用化学方法(添加有机溶剂或表面活性剂或二者复合)以提高菌体通透性，但有机溶剂或表面活性剂都有一定的毒性，不仅污染环境，危害人体健康，而且会给ATP的分离提取造成一定的困难，干燥方法虽已有研究，但由于菌种、工艺等原因而效果欠佳［3］，本文通过系统研究毛霉菌通透化方法，筛选出一种更加高效且绿色环保的干燥方法，使反应过程中相关酶活力更加稳定，且利于ATP的分离提取，有效解决了化学方法的不足之处，具有广阔的应用前景。

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Effects of Cell Permeability on the Activity of Actinomucor elegans for ATP Production from Adenine

Zhu Jia-rong，Yang Guang-hui，Yang Shan-yan，Qiu Juan-ping
(College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China)

Methods related to the modification of cell permeability were studied systematically in Actinomucor elegans.The correlation between cell membrane permeability determined by electrical conductivity method and cell enzymatic activity for ATP production from adenine was investigated.As a result，drying method was selected.After optimization by drying method in production process，10.13 g/L ATP was accumulated from 3 g/L adenine and the molar conversion ratio was 82.76%，which increased by 202.39%compared with the control group.Electrical conductivity of treatment group was obviously higher than that of the control group and the correlation between electrical conductivity and drying time was alike with the correlation between ATP production and drying time，which proved that drying method increased cell membrane permeability and ATP production.

drying method，organic solvent，surfactant，electrical conductivity

学士，副教授(本文通讯作者)。

2011－05－16，改回日期:2011－06－23