蛹虫草液态发酵过程中有效成分的动态积累变化*

罗巍，刘东波，吴郑武，夏志兰，谢红旗

1(湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙，410128)2(国家中医药管理局亚健康干预技术实验室，湖南长沙，410128)3(湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室，湖南长沙，410128)

蛹虫草液态发酵过程中有效成分的动态积累变化*

罗巍1，2，刘东波1，2，吴郑武1，2，夏志兰1，2，谢红旗1，3

1(湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙，410128)2(国家中医药管理局亚健康干预技术实验室，湖南长沙，410128)3(湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室，湖南长沙，410128)

通过对蛹虫草4号菌株进行摇瓶液态发酵培养，考察了蛹虫草发酵过程中发酵液及菌丝体生物量、虫草多糖、虫草酸及虫草素含量的动态积累变化情况。结果表明:70%以上的虫草多糖、虫草酸、虫草素分布在发酵液中。蛹虫草菌在第10天生物转化量达到最大值20.44 mg/mL，虫草酸、虫草多糖、虫草素含量分别在第11、13、14天达到最大值，综合考虑3种产物的最佳发酵周期，将蛹虫草发酵时间定为12 d。10 L发酵罐深层培养试验的结果表明，生物量达24.5 mg/mL，比摇瓶培养提高19.86%，而虫草酸、虫草多糖、虫草素含量分别为7.43、2.82、90.73 μg/mL，比摇瓶培养分别提高8.3%、13.7%和15.6%。

蛹虫草，虫草多糖，虫草酸，虫草素，液态发酵

蛹虫草(Cordycps militarisc Link)又名北冬虫夏草，属真菌门、子囊菌亚门、核菌纲、麦角菌目、麦角菌科、虫草属，是冬虫夏草的近缘种［1］，是我国历史上十分名贵的珍稀、营养、滋补、保健及药用真菌［2－3］。尤其近年来研究证明，蛹虫草所含虫草活性成分如虫草酸、虫草素、虫草多糖、超氧化物歧化酶(SOD)、腺苷等含量明显高于天然冬虫夏草［4］。并且由于虫草区域生态环境的脆弱性及人们长期的乱采滥挖，野生虫草资源早已濒临枯竭［5］。积极开展蛹虫草生物学特性及人工种植技术的研究，具有十分重大的现实意义和显著的经济价值。

目前，我国蛹虫草固体栽培技术已得到广泛应用，并大面积推广，虽然通过发酵工程技术进行蛹虫草菌丝体生产也有了一定的发展，但国内外对蛹虫草的液态发酵研究主要集中在发酵条件的优化及有效成分的检测方面［6－8］，而对于发酵过程中有效成分的动态积累研究甚少，蛹虫草发酵培养时间也参差不齐。工业生产中，一般既要获得目标产物的最大产量，还要节省生产成本。因此，研究蛹虫草发酵过程中有效成分的动态积累情况对指导蛹虫草液体发酵生产具有重要的意义。

1 材料和方法

1.1 菌种来源、仪器和试剂

1.1.1 供试菌株

蛹虫草4号菌种由湖南农业大学食用菌研究所提供。

1.1.2 仪器

恒温水浴锅(DK-S24型)，上海精宏实验设备有限公司;超净工作台(SW-CJ-2F型)，苏州净化设备有限公司;电热鼓风干燥箱(101-4AB型)，北京中行伟业仪器有限公司;真空干燥箱，台式离心机(KA-1000型)，上海安亭科学仪器厂;恒温培养振荡器(ZHWY-2102C型)，上海智城分析仪器制造有限公司;立式压力蒸汽灭菌器(LDZX-50FAS)，上海申安医疗器械厂;紫外分光光度计(U-3310型)，日本岛津公司;高效液相色谱(Prominence UFLC-20A型)，日本岛津公司。

1.1.3 试剂

葡萄糖，蔗糖，蛋白胨，KH2PO4，MgSO4，酵母膏，甘露醇，乙醇，高碘酸钠，醋酸铵，鼠李糖，HCl，高碘酸钠，苯酚，浓H2SO4，冰醋酸，乙酰丙酮，以上试剂均为分析纯，甲醇(色谱纯)，虫草素标准品(Sigma公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 制备斜面菌种

按无菌操作对4号菌株进行转管接种，在22℃下恒温培养，直到菌丝长满斜面培养基(斜面培养基为PDA培养基)。

1.2.2 液态摇瓶发酵

液态发酵培养基如下:蔗糖2.4%、葡萄糖1.2%、蛋白胨 0.4%、酵母浸出粉 0.2%、KH2PO40.15%、MgSO4·7H2O 0.1%。pH 为 6.5～6.8，温度22℃，转速130 r/min，摇床黑暗中培养。

每个500 mL三角瓶分装100 mL液体培养液，灭菌冷却后将4号菌株的斜面菌种分别接入三角瓶内，按上述条件置恒温振荡器上培养。培养期间，从培养的第3天至第21天每天取三角瓶3个，抽滤分离菌丝体和发酵液后分别进行取样检测。

1.2.3 发酵罐深层发酵试验

在摇瓶实验的基础上，进行10 L发酵罐深层培养。发酵罐发酵条件为:罐压 0.05 MPa、搅拌速度130 r/min、空气流量 210 L/h、培养温度22℃、添加质量分数为0.03% 的食用消泡剂(主要成分为单甘脂、磷脂、轻质碳酸钙等)。培养基配方如1.2.2所述条件，接种菌龄为5 d，接种量10%，发酵时间12 d。

1.2.4 生物量测定

将培养好的发酵液，经过抽滤得到菌丝体滤饼，50℃真空干燥至恒重，用电子天平称量。

1.2.5 胞外多糖分析

测量上述收集的滤液体积，加3倍体积的95%乙醇沉淀多糖，置于4℃冰箱中过夜，沉淀多糖用蒸馏水复溶后，采用苯酚-硫酸法测定多糖浓度［9］。

1.2.6 菌丝体胞内多糖分析

称取一定量干燥菌丝体，粉碎，加20倍体积蒸馏水，100℃水浴浸提3 h，高速离心(4000 r/min)10 min，收集上清液，加入3倍体积9 5%乙醇沉淀，置于4℃冰箱过夜，过滤，多糖用蒸馏水复溶，苯酚-硫酸法测定多糖浓度。

1.2.7 虫草酸含量测定

精密称取0.5 g菌丝体干粉，置于50 mL三角瓶中，加25 mL蒸馏水，置80℃水浴中，浸提1.0 h，离心，上清液转入25 mL容量瓶中，残渣用水洗涤2次，定容。取发酵液及菌丝体提取液稀释至所需浓度，按文献［10］测定虫草酸含量。

1.2.8 虫草素检测

菌丝体加液氮研磨成粉末，称取粉末0.1 g加入2 mL纯净水，超声波100 W、60℃处理50 min，4000 r/min离心10 min，取上清液，重复提取3次，合并上清液，过0.45μm滤膜后采用高效液相色谱检测虫草素含量，发酵液直接过0.45 μm滤膜后，进行高效液相色谱检测。色谱条件［11］:色谱柱:Shim-pack vp-ODS(150mm × 4.6mm，5μm);流动相:V(水)∶V(甲醇)=85∶15，流速 0.8 mL/min;检测波长 260 nm，进样量 10 μL，柱温35 ℃。

2 结果与分析

2.1 蛹虫草在发酵过程中生物量的变化情况

本次试验测量了4号蛹虫草菌种从第3天至第21天的生长量，蛹虫草不同发酵时间生物量的变化情况如图1所示。从图1可以看出，生物转化量从第3～10天处于不断上升的阶段，在第10天达到最大值，在第10～14天，生长量处于稳定的，不再上升的阶段。从第15天开始菌丝生长量呈下降趋势，原因可能是菌株在有限的营养浓度内，菌丝体达到最大增长限度后，自身开始产生或外溢一些代谢副产物和中间产物，并伴随着菌丝体自溶现象所致。试验结果表明，生长量的积累并不是随着培养时间的增加而不断上升，而是在某一时间达到一个最大值后不再上升基本保持稳定，因此在第10天采收菌丝体较佳。

图1 蛹虫草不同发酵时间的变化曲线

2.2 虫草多糖的动态积累变化情况

本实验检测了蛹虫草在第3～21天的发酵液和菌丝体中虫草多糖含量，不同培养时间发酵液和菌丝体中虫草多糖含量及产量如图2所示。由图2可知，在蛹虫草发酵过程中，在第13天发酵液中虫草多糖含量达到最大值2.48 mg/mL，然后逐渐减少，至第18天发酵液中虫草多糖含量减至0.35 mg/mL，然后基本保持不变。而菌丝体中虫草多糖含量也第13天达到最大值48.93 mg/g，然后逐渐减少，但是，菌丝体中虫草多糖与发酵液比较，其多糖含量减少量较小，在第18d后减少至32.35 mg/g，后也基本保持在这一含量不变。在第6～14 d中，发酵液中多糖产量是菌丝体中多糖产量的3倍左右，说明在这期间，虫草发酵液中虫草多糖产量占总量的75%以上。其中发酵液中多糖含量的随时间的减少可能是因为随着整个发酵液中营养成分的消耗，虫草菌开始消耗发酵液中虫草多糖，以维持其生长，所以发酵液中虫草多糖在14～18 d内大量的减少。而菌丝体中多糖含量的减少可能是部分多糖转化为其他产物或供菌丝自身生长。因此，如以生产虫草多糖为目的的液态发酵，最佳培养时间为13天。

图2 蛹虫草不同发酵时间虫草多糖积累变化曲线

2.3 虫草酸的动态积累变化情况

本实验检测了蛹虫草在第3～21天的发酵液和菌丝体中虫草酸含量，不同培养时间发酵液和菌丝体中虫草酸含量及产量如图3所示。由图3可知，在蛹虫草发酵过程中，在第3～10天内，发酵液及菌丝体中，虫草酸含量急剧增加，直到第11天，两者中虫草酸含量都达到最大值6.86 mg/mL和150.08mg/g。从第13～17天，两者虫草酸含量都急剧下降，而发酵液中虫草酸减少量远大于菌丝体中虫草酸减少量。有文献报道，以甘露醇作为碳源进行蛹虫草的液态发酵，其发酵效果最佳，生物量最大［12］，虫草酸即 D-甘露醇，是甘露醇的异构体，因此发酵液中虫草酸含量在14～17天内，急剧减少，而后基本保持不变，可能由于营养成分的消耗，虫草菌消耗其代谢产生的虫草酸，来维持自身生长代谢，甚至消耗体内多余虫草酸以供自身代谢，以至菌丝体中虫草酸含量也在13～17天内剧减。综上所述，以生产虫草酸为目的的蛹虫草液体发酵，最佳培养时间为11天。

2.4 虫草素的动态积累变化情况

本实验检测了蛹虫草在第3～21天的发酵液和菌丝体中虫草素含量，不同培养时间发酵液和菌丝体中虫草素含量及产量如图4所示。由图4可知:在蛹虫草液体发酵过程中，从第4天开始，发酵中虫草素产量大于菌丝体中虫草素产量。第9天后，发酵液中虫草素产量是菌丝体中虫草素产量的2.5倍以上，即这期间，70%以上的虫草素分泌在发酵液中。而虫草素在发酵液和菌丝体中的积累量都在14天基本达到最大值78.44 μg/mL 和1429.10 μg/g。第14天后，虫草素产量虽然有略有增加，但是比之14天总产量增加不到1%。所以综合考虑，以生产虫草素为目的的液体发酵，最佳培养时间为14 d。

图3 蛹虫草不同发酵时间虫草酸积累变化曲线

图4 蛹虫草不同发酵时间虫草素积累变化曲线

2.5 发酵罐培养情况

氧是好氧发酵的限制性基质，所以氧的提供往往就成为产物形成的重要影响因素。早在20世纪50年代，就有学者提出以 KLa为原则进行发酵工艺放大，并在实践中取得了较好的结果［13］。在摇瓶实验的基础上，综合考虑虫草酸、虫草多糖、虫草素产量，12 d是较为合适的发酵周期，本实验以 KLa相同原则进行10 L发酵罐放大培养12d，蛹虫草10 L发酵罐培养情况如表1所示。

表1 蛹虫草10L发酵罐培养情况

由表1可知，蛹虫草在10 L发酵罐培养过程中， 菌丝体内虫草酸，虫草多糖，虫草素变化规律基本与摇瓶培养中其物质含量变化规律一致。但是生物量达24.5 mg/mL，比摇瓶培养提高19.86%，而虫草酸、虫草多糖、虫草素含量分别为7.43、2.82、90.73 μg/mL，较之摇瓶培养分别提高 8.3%、13.7%、15.6%。

3 结论

(1)本研究通过对蛹虫草4号菌株的液体发酵，比较研究了虫草酸、虫草多糖、虫草素在液体发酵过程中的动态积累变化情况，确立了以虫草酸、虫草多糖、虫草素为生产目的的液体发酵的最佳发酵周期分别为11 d、13 d、14 d，以及这3种产物的综合发酵周期为12d。 (2)研究表明，蛹虫草液体发酵过程中，70%以上的虫草酸、虫草多糖、虫草素都分布在发酵液中，而随着培养时间的延长，在虫草菌的衰退期，虫草酸、虫草多糖出现大幅下降，而虫草素却有少量的增加。

(3)蛹虫草10 L发酵罐培养获得的目的产物较之摇瓶培养都有大幅提高，本研究工作对蛹虫草深层培养规模的放大具有一定的理论指导意义。

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Study on the Active Components Accumulation in Cordceps militaris Throngh Femention Process

Luo Wei1，2，Liu Dong-bo1，2，Wu Zheng-wu1，2，Xia Zhi-lan1，2，Xie Hong-qi1，3
1(College of Horticulture and Landscape，HunanAgriculturalUniversity，Changsha 410128，China)2(State Administration of Traditional Chinese Medicine Sub-health Intervention Technology Laboratory Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China)3(Key Laboratory for Crop Germplasm Innovation and Utilization of Hunan Province，Changsha 410128，China)

The dynamic variation of the accumulation of biomass，Cordyceps polysaccharides，cordycepic acid and cordycepin were compared through fermentation process.The results showed that 70%of Cordyceps polysaccharide，Cordyceps acid and cordycepin was distributed in the fermentation broth.The optimum fermentation period was 12d by considering these three products.The results of 10 L fermentation tank submerged culture test showed that the biomass reached 24.5 mg/mL，which increased 19.86%compared with shaking flask culture，while the Cordyceps acid，CP，cordycepin content were 7.43 mg/mL，2.82 mg/mL，90.73 μg/mL respectively，which increased 8.3%，13.7%and 15.6%compared with shaking flask culture.

Cordyceps militaris，cordycepic acid，cordycepin，Cordyceps polysaccharide

硕士研究生(谢红旗副教授为通讯作者)。

*湖南农业大学人才基金(08YJ15);湖南省教育厅科学研究项目(09C499);作物种质创新与资源利用重点实验室科学基金开放项目(10kfxm11)

2011－04－13，改回日期:2011－05－24