乳酸杆菌及其体外表达系统在临床中的应用及其前景

王青元，周 颖（综述），凌 斌（审校）

（安徽医科大学附属省立医院妇产科分子实验室，安徽省分子医学重点实验室，合肥 230001）

乳酸杆菌，因发酵糖产生大量乳酸而命名。该菌广泛存在，嗜酸性、兼性厌氧，生存最适环境为pH 5.5～6.0，但是 pH 3.0～4.5 时仍能生存，在无芽胞杆菌中其耐酸力最强。过氧化氢酶试验和联苯胺试验均为阴性，吲哚试验、硫化氢试验、淀粉水解试验均呈阴性。作为益生菌，乳酸杆菌在日常生活及临床应用较为广泛，如生产酸奶、治疗阴道疾病、生产疫苗等。现就乳酸杆菌及其体外表达系统在临床中的应用综述如下。

1 乳酸杆菌的表达系统

1.1 培养条件 乳酸杆菌，营养要求严格，除碳水化合物外，需要多种氨基酸、维生素、肽等。目前实验室一般采用的培养基有:MRS肉汤培养基、MRS琼脂培养基和番茄汁培养基，选择在含有5%CO2的厌氧罐中发酵式培养。

1.2 表达质粒 大多数乳酸杆菌均含有质粒，少数还含有多种质粒且乳酸杆菌质粒多具有隐蔽性、遗传稳定性、含抗生素基因及小型质粒拷贝数高等特点。乳酸杆菌虽然是食品级安全菌，但并不是所有的乳酸杆菌及其质粒都适合体外表达蛋白及在临床中应用。目前分离及改造的乳酸杆菌质粒按安全范围分为食品级和非食品级，按照宿主范围分广宿主和窄宿主两种［1］。食品级、宿主范围较窄的乳酸杆菌质粒更适合在医学中应用，如pSUW611、pSUW711、pNZ8048、pFMN30［2-4］等。

1.3 诱导表达及启动子随着乳酸杆菌分子生物学及基因工程技术的发展，已分离出了乳酸杆菌的各种表达调控元件，对乳酸杆菌基因转录和翻译调控及蛋白质分泌机制有了进一步的了解。研究发现乳酸杆菌质粒中普遍存在两种调控序列:一种是与基因复制起始相关的序列，另一种是控制质粒拷贝数和不相容性的DNA序列。质粒的拷贝数是由DNA非编码序列中的重复序列和反转录RNA来控制的。与基因复制起始相关的序列分两类:一类是编码蛋白的开放阅读框架，在乳酸杆菌中与质粒复制相关的开放阅读框架之间存在同源性;另一类是与调控有关的非编码序列，包括复制相关蛋白作用的靶序列、正-负向复制起始点、缺失位点、启动子等复制调控元件［1，5］。其中乳酸杆菌的启动子对乳酸杆菌具有高度的选择性，故在乳酸杆菌表达系统中，很少使用外源性启动子，目前已成功用于表达外源性蛋白的启动子有 lacA、lacR、lacF、T7、xylA、lacS、nisA、nisZ、nisF、usp等，这些启动子的诱导物都是食品级的，如乳糖、木糖和乳球菌素等，易于构成食品级乳酸杆菌表达系统，提高乳酸杆菌工程菌株的安全性。

2 乳酸杆菌在疾病预防和治疗中的应用

乳酸杆菌是在人体内胃肠道和泌尿生殖道中定植的正常菌群，在疾病预防、治疗以及抗衰老、抗肿瘤等方面发挥重要的生理功能。

2.1 预防疾病

2.1.1 调节机体微生态平衡 乳酸杆菌作为胃肠道和泌尿生殖道中的优势菌群通过黏附定植和竞争性抑制及产生杀菌性物质（如乳酸、过氧化氢、细菌素、生物表面活性物质等）等维持机体内菌群的种类、数量及比例协调，从而维持机体微生态平衡。

2.1.2 免疫功能 乳酸杆菌能够促进体液免疫和细胞免疫的形成，激活免疫系统。对于非特异性免疫系统，乳酸杆菌主要通过增强黏膜屏障功能、增强体内吞噬细胞的吞噬功能、增强自然杀伤细胞的杀伤作用、刺激机体产生各种细胞因子，如白细胞介素2、干扰素 γ、白细胞介素12、干扰素 α、白细胞介素10等且不同的乳酸杆菌菌株产生的细胞因子不尽相同［6］;对于特异性免疫系统，乳酸杆菌能够增强T细胞的分化、增殖能力，提高T细胞的数量。同时能够刺激特异性免疫应答，如增加黏膜表面和血清中IgA和IgM、IgG水平以强化体液免疫，促进T、B淋巴细胞的增殖和成熟，加强细胞免疫。乳酸杆菌还能减少特异性皮炎的发生，减轻变态反应程度、调节Th1/Th2平衡。此效应是通过菌群基因组DNA刺激外周血单核细胞诱导产生的，且与乳酸杆菌进入机体的剂量有关［7］。

2.2 抗感染作用 乳酸杆菌在治疗胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道的感染性疾病中发挥重要作用。创伤、感染患者机体内大多存在胃肠道过度炎性反应，严重者可引起脓毒血症和多器官功能障碍。Chu等［8］研究显示，乳酸杆菌能减轻肠道炎性反应，降低肠道内毒素血症。Chiba等［9］实验证实，给予大鼠活性乳酸杆菌，增强细胞整体免疫功能，同时使鼻腔内淋巴细胞产生干扰素γ和肿瘤坏死因子α增多，有利于机体清除流感病毒。Graver等［10］研究发现，在缺氧环境中生长的乳酸杆菌主要通过产酸来抵抗淋病奈瑟菌的感染，并不产生过氧化氢。研究发现，患有下呼吸道感染的儿童70%伴有肠道菌群紊乱，表现在乳酸杆菌优势水平下降，肠球菌增殖，尤其并发肺炎的患儿［11］。正常女性阴道内含有多种细菌，其中乳酸杆菌占绝对优势，维持菌群平衡。一旦乳酸杆菌的优势地位丢失，各种致病菌大量繁殖是细菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、霉菌性阴道炎发生和复发的主要原因。研究发现，阴道炎的患者口服或阴道局部应用乳酸杆菌制剂有助于改变阴道内环境、降低并发症和复发率。

2.3 抗衰老作用 乳酸杆菌能减少机体有毒产物（组胺、酪氨、腐胺、硫化氢、吲哚、亚硝酸盐和酚类等）的产生与吸收［12］，有利于脏器功能的正常发挥及衰老进程的延缓。乳酸杆菌还可有效参与机体抗氧化反应，提高过氧化物酶和还原型谷胱甘肽的水平。Van Nieuwenhove［13］等将乳酸杆菌应用于肝损伤小鼠，探讨其对肝内脂质过氧化反应及自然杀伤细胞活性的影响。结果显示，乳酸杆菌能提高脾脏内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性及还原性谷胱甘肽水平，降低丙二醛水平。

2.4 抗肿瘤作用 乳酸杆菌在维持机体菌群平衡中起重要作用，如果乳酸杆菌的数量或者活性降低会导致机体微生态平衡被打破，致病菌群会大量繁殖。致病菌产生的代谢物质会促使机体内的癌前体物质向致癌物质转化，从而诱发癌变。乳酸杆菌能够恢复肠道菌群平衡，拮抗肠道中病原菌生长，使细菌酶的产生及活性降低，还可结合致癌物质随粪便排出，减少了其形成、活化及滞留的机会。研究报道乳酸杆菌能够防止幽门螺杆菌的感染并有一定的治疗作用，因而间接地降低了胃癌的发病率。大量动物实验表明，乳酸杆菌能够抑制Lewis肺癌、ethA纤维瘤、B16黑素瘤、膀胱癌、淋巴瘤等多种肿瘤的发生、转移与复发［14］。

乳酸杆菌可激活机体免疫系统，特别是巨噬细胞、自然杀伤细胞和B淋巴细胞。其中巨噬细胞抗瘤作用具有重要意义，巨噬细胞可能是通过内吞和分泌肿瘤坏死因子α、白细胞介素2等效应因子，促进肿瘤细胞凋亡而发挥抗瘤效应。乳酸杆菌表面的肽聚糖、脂磷壁酸以及源于细菌DNA中的大量非甲基化CpG二核苷酸为核心的CpG基序可直接诱导肿瘤细胞的分化和凋亡。CpG基序可活化巨噬细胞、自然杀伤细胞、B细胞等免疫细胞，从而具有免疫调节活性。细菌核酸中含有CpG基序的部分还通过与人体细胞表面特异性受体——Toll样受体家族中的Toll样受体9（Toll-like receptor，TLR9）相结合，激活机体的天然免疫反应［15-17］。乳酸杆菌基因组AT核苷酸也可以通过与TLR9结合来增强TH1型免疫反应，上调抗肿瘤免疫反应水平［18］。

乳酸杆菌细胞壁中的肽聚糖和脂磷壁酸是NO合成酶的诱导剂，它们能刺激巨噬细胞和其他免疫细胞产生NO。NO是生物体重要的信号分子和活化巨噬细胞的效应分子，可通过以下途径发挥抗肿瘤作用:①与肿瘤细胞代谢关键酶的活性部位FeS基结合，形成铁亚硝基复合物，使酶失活，继而引起肿瘤细胞能量代谢障碍;②可灭活DNA合成的限速酶——核糖核酸酶，进而抑制肿瘤细胞增殖;③可使核酸亚硝基化，导致DNA断裂，最终诱导肿瘤细胞凋亡;④NO与氧结合，形成强有力的杀伤细胞的羟自由基和 NO2［19］。Horinaka 等［20］发现乳酸杆菌能诱导外周血单核细胞产生TRAIL（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand），同时，他们发现乳酸杆菌激活自然杀伤细胞对前列腺癌的杀伤作用是通过诱导外周血单核细胞产生TRAIL的途径实现的。

实体瘤具有低氧代谢区，乳酸杆菌属于兼性厌氧菌具有趋低氧代谢特性，对实体瘤有良好的靶向性，并且能够通过产生过氧化氢和激肽酶发挥抗实体瘤作用。因此，某些乳酸杆菌可用于肿瘤治疗，或作为肿瘤基因治疗的转移载体在肿瘤低氧区域选择性富集而达到基因治疗目的。

3 基因工程乳酸杆菌的临床应用

由于乳酸杆菌在改善胃肠道功能、维持机体内环境稳定、提高机体免疫力方面的突出功用，近年来，以乳酸杆菌为宿主菌的基因治疗、重组蛋白表达和疫苗制备等方面的研究受到国内外科研工作者的高度重视。

3.1 基因治疗 美国和海外研究人员［21］利用人体阴道内生菌开发出一种活性、外用杀菌剂，可以诱导1型人体免疫缺陷病毒蛋白抑制剂的生成并最终防止该病毒的传播。在这项研究中，研究人员利用从人体阴道分离出的詹氏乳酸杆菌，通过工程化改造，使其可以产生对抗1型人体免疫缺陷病毒受体蛋白的抗1型人体免疫缺陷病毒蛋白质RANTES和CIC5 RANTES。两种RANTES蛋白质变体均可抑制1型人体免疫缺陷病毒感染，并对多种1型人体免疫缺陷病毒遗传亚型有显著的抑制作用。

3.2 细胞因子等功能蛋白的体外表达 利用现代基因工程和生物工程技术，以乳酸杆菌为载体或宿主菌表达一些特定功能的蛋白或多肽，可赋予双歧杆菌更多的医用价值。目前，国内外很多实验室已经掌握了乳酸杆菌体外表达融合蛋白的技术并成功表达了很多功能蛋白。Miyoshi等［22］通过基因工程方法剔除了乳酸杆菌细胞外管家蛋白酶HtrA基因，从而使异源蛋白在乳酸杆菌中大量而稳定地表达。

3.3 疫苗 理想的黏膜免疫疫苗可以促进抗原和免疫系统之间的有效接触、刺激体液和细胞免疫反应、在单剂量免疫以后产生长期的免疫保护作用，并且稳定、无毒性。乳酸杆菌因良好的安全性和免疫佐剂作用，可以作为一种良好的疫苗载体。与采用腺病毒、沙门菌和大肠埃希菌等致病菌为载体的疫苗相比，以乳酸杆菌为载体的疫苗用药更加安全，适宜多次重复免疫的要求，更适应未来疫苗的发展趋势。用乳酸杆菌作为疫苗载体可使口服的乳酸杆菌在体内刺激产生黏膜及全身免疫反应，促进IgA的分泌，提高免疫活性因子的分泌。Aires等［23］利用干酪乳酸杆菌的乳糖操纵子表达系统成功表达了人乳头状瘤病毒16的主要衣壳蛋白L1，并通过电子显微镜证实表达的衣壳蛋白L1能够自我组装进入VLPs（virus-like particles）细胞内。同时，ELISA实验验证了小鼠皮下注射乳酸杆菌表达的衣壳蛋白L1后的小鼠血清中含有人乳头状瘤病毒16 L1 VLPs的抗体，为进一步开发研究宫颈癌的黏膜预防疫苗奠定基础。

4 展望

乳酸杆菌是益生菌的重要组成成员，在人体胃肠道和泌尿生殖道中以优势菌群广泛存在，其本身及其产生的代谢产物，如短链脂肪酸、过氧化氢、细菌素、蛋白质和各种酶类等，在机体代谢、免疫调节等方面起着极为重要的作用。随着现代科学技术的发展，基因组学和蛋白质组学蓬勃发展，人们已经不满足于仅开发乳酸杆菌自身的食品及临床应用价值。近几年，乳酸杆菌因具有食品级安全性和局部黏膜定植性及免疫佐剂等特殊性，被广泛应用于疫苗载体的研究，不断开发和衍生出了许多更适合功能蛋白表达、分泌和功能发挥的菌株和载体质粒。但是，目前这方面的成果还局限于科学研究和动物实验中，有待于大量的临床资料验证。伴随乳酸杆菌工程菌研究技术的不断成熟，科研人员已经将乳酸杆菌研究的热点转移到某些重要细胞因子和功能蛋白的融合表达，试图借助乳酸杆菌良好的靶向定植和免疫佐剂功能，将某些重要的细胞因子和功能蛋白大量表达在病灶局部，以期发挥显著的治疗作用。目前，针对乳酸杆菌的研究，已经取得了很大的进步，但也有很多亟待研究的地方。①乳酸杆菌自身如何发挥重要的免疫调节、抗感染、抗肿瘤等作用的分子机制并不清晰。②乳酸杆菌制剂的质量、应用于临床的剂量和时机以及后期疾病转归等缺乏大量病例资料统计、归纳。③乳酸杆菌作为原核生物表达的蛋白多为胞内蛋白，如何将重组蛋白分泌到胞外且具备人体内正常的折叠、修饰和生物学功能等需要后期大量的研究。④乳酸杆菌作为疫苗、重要细胞因子和功能蛋白的载体时，一旦这些蛋白进入人体细胞或释放到外环境中，导致的结果尚不明确。随着乳酸杆菌基因工程表达系统的完善及深入研究，乳酸杆菌在未来的食品生产和临床应用中将展示出广阔的应用前景。

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