高产β-半乳糖苷酶植物乳杆菌的筛选及其酶学性质研究

谷月华，张京声，安浩然，郝彦玲

（中国农业大学 食品科学与营养工程学院，北京 100083）

高产β-半乳糖苷酶植物乳杆菌的筛选及其酶学性质研究

谷月华，张京声，安浩然，郝彦玲

（中国农业大学 食品科学与营养工程学院，北京 100083）

β-半乳糖苷酶不仅能通过分解乳制品中乳糖解决乳糖不耐症问题，同时能通过转糖苷作用合成具有益生功能的低聚半乳糖。从8株植物乳杆菌中筛选出高产β-半乳糖苷酶菌株K2，比活力高达6620 U/g，并对β-半乳糖苷酶酶学性质进行研究。结果表明：β-半乳糖苷酶最适和最稳定的pH值为6.5，最适温度为60℃，而在40℃稳定性最强。Mg2+对β-半乳糖苷酶活力有明显促进作用，而Cu2+有强烈抑制作用，通过推导求得米氏常数Km,oNPG=1.15 mmol/L，最大反应速率Vmax,oNP=6.34 μmol/（min·mg）。研究结果为具有解决乳糖不耐受症的植物乳杆菌微生态制剂的开发奠定了基础。

β-半乳糖苷酶；植物乳杆菌；酶学性质

0 引 言

原发性乳糖酶缺乏导致的乳糖不耐症是目前影响最大的营养代谢障碍之一，我国88.9%的成年人有乳糖酶缺乏，55.1%的成年人有乳糖不耐症状[1-2]。乳糖不耐症的主要解决方法是利用β-半乳糖苷酶分解乳制品中乳糖[3]。β-半乳糖苷酶还能转糖苷合成有益生功能的低聚半乳糖（GOS）[4-5]。

植物乳杆菌是人体胃肠道益生菌，具有维持肠道菌群平衡和提高机体免疫力等功能[6-7]。Rhee等对从泡菜中筛选出的植物乳杆菌β-半乳糖苷酶活性进行了研究[8]；Iqbal等将植物乳杆菌的β-半乳糖苷酶基因作同源过表达并研究其酶学性质及转糖苷作用[9]；而国内还未有相似报道。本文筛选到一株分离自新疆酸马奶中高产β-半乳糖苷酶的植物乳杆菌并系统研究其酶学性质，研究结果为解决乳糖不耐症的植物乳杆菌微生态制剂的开发奠定基础。

1 实 验

1.1 材料

（1）菌株来源：植物乳杆菌F1分离自腊肠，植物乳杆菌LB-B1、G4和K2分离自新疆酸马奶，植物乳杆菌7-4-3、07-191和WQ0815分离自四川泡菜，植物乳杆菌05-19分离自保健品。

（2）培养基与试剂：高产β-半乳糖苷酶植物乳杆菌筛选培养基为改良MMRS液体培养基（MMRS培养基中用乳糖替代葡糖糖作为碳源）。

1.2 方法

1.2.1 高产β-半乳糖苷酶植物乳杆菌的筛选

（1）植物乳杆菌产β-半乳糖苷酶粗酶液制备。将8株植物乳杆菌按体积分数为1%的接种量接种于改良MMRS液体培养基中，37℃静置培养24 h，将培养好的菌液5 000 r/min离心10 min后弃上清，沉淀经预冷的磷酸缓冲盐溶液洗涤后，在冰浴中进行超声波破碎，裂解后的菌液于4℃12 000 r/min离心10 min，收集粗酶液。

（2）β-半乳糖苷酶活力测定。取0.1 mL粗酶液与0.9 mL浓度为0.01 mol/L邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）的0.05 mol/L磷酸钠缓冲液（pH值为6.5）混匀37℃反应10 min后，加入1.5 mL浓度为0.4 mol/L的Na2CO3终止液静置5 min，于420 nm比色测定生成邻硝基苯酚（ONP）浓度。1个酶活性单位（U）定义为在37℃下每分钟分解出1 μmol ONP所需的酶量。以BSA为标准品，采用Bradford法测定粗酶液中总蛋白量。将酶活性换算为比酶活，以U/g蛋白表示。

1.2.2 β-半乳糖苷酶酶学性质

（1）pH值对β-半乳糖苷酶活力和稳定性的影响。测定β-半乳糖苷酶粗酶液在不同pH值的浓度为0.05 mol/L缓冲液中酶活力，确定pH值对β-半乳糖苷酶活力的影响。缓冲液分别为醋酸钠（pH值为4.5，5.0和5.5）、磷酸钠（pH值为6.0，6.5，7.0和7.5）和Tris-HCl（pH值为8.0，8.5和9.0），相对酶活用百分比来表示。将β-半乳糖苷酶在上述缓冲液中37℃保温2 h和24 h后，测残留的酶活力，分析pH值对β-半乳糖苷酶稳定性的影响。

（2）温度对β-半乳糖苷酶活力和稳定性的影响。测定β-半乳糖苷酶粗酶液在不同温度 （温度范围为25～75℃）时的酶活力，确定温度对β-半乳糖苷酶活力的影响。将β-半乳糖苷酶与浓度为0.05 mol/L磷酸钠缓冲液（pH值为6.5）混匀后，分别在30，40，50，和60℃保温4 h，每隔1 h测一次残留的酶活，分析温度对β-半乳糖苷酶稳定性的影响。

（3）不同金属离子及离子浓度对β-半乳糖苷酶的影响。将β-半乳糖苷酶与浓度为0.05 mol/L磷酸钠缓冲液（pH值为6.5）混匀，并添加各种不同的金属离子（K+、Na+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Cae、Zn2+和Fe3+） 至终浓度分别为1，10和100 mmol/L，于37℃测定酶活。

（4）β-半乳糖苷酶动力学常数的测定。由双倒数作图法（Lineweaver–Burk plots）测定β-半乳糖苷酶的酶促反应动力学常数米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax）[10]。

2 结果与分析

2.1 高产β-半乳糖苷酶植物乳杆菌的筛选

对8株植物乳杆菌产β-半乳糖苷酶比活力的测定，结果如图1所示。由图1可以看出，植物乳杆菌7-4-3的乳糖酶活力最低，仅为1283 U/g，而植物乳杆菌K2比活力最高，达到6620 U/g。因此植物乳杆菌K2作为后续研究对象。

2.2 pH值对β-半乳糖苷酶活力和稳定性的影响

pH值对酶催化反应的影响分别为影响酶催化底物转变成产物效率以及酶的稳定性。在pH值为4.5～9.0范围内测定β-半乳糖苷酶的活性，结果如图2所示。由图2可以看出，β-半乳糖苷酶的最适pH值为6.5。当pH值为6.5时，β-半乳糖苷酶37℃保温24 h后仍有80%的活力。因此β-半乳糖苷的最适酶活力和稳定性皆是pH值为6.5。

2.3 温度对β-半乳糖苷酶活力和稳定性的影响

测定在不同温度时β-半乳糖苷酶粗酶液的酶活力，确定温度对β-半乳糖苷酶活力的影响，结果如图3所示。由图3可以看出，60℃时，β-半乳糖苷酶活力最高。随着温度升高，β-半乳糖苷酶活力急速下降，75℃时仅残留19%。由图4可以看出，在30℃和40℃时，保温处理4 h后仍有85%酶活力，而在最适温度60℃时，仅处理30 min后基本失去活性。人体内的温度为37℃，pH值为近中性，因此，作为益生菌的植物乳杆菌K2所产β-半乳糖苷酶在人体内具有解决乳糖不耐症的前景。

2.4 不同金属离子及离子浓度对β-半乳糖苷酶的影响

不同金属离子及离子浓度对β-半乳糖苷酶的影响结果如表1所示。由表1可以看出，在各种金属离子中，K+、Na+、Mg2+和Mn2+在适当浓度范围内对β-半乳糖苷酶酶活有促进作用，但随着浓度增加，促进作用减弱或变成抑制，其中Mg2+对β-半乳糖苷酶活力的促进效果最明显，当添加浓度为10 mmol/L的Mg2+时，酶活力达到112.24%。Fe3+、Fe2+、Ca2+、Zn2+和Cu2+对β-半乳糖苷酶酶活有抑制作用，且随浓度增加抑制作用加强，其中Cu2+的抑制作用最强，在反应液中加入浓度为1 mmol/L后β-半乳糖苷酶即失去活力。

表1 金属离子对植物乳杆菌K2的β-半乳糖苷酶活性的影响

2.5 β-半乳糖苷酶动力学常数的测定

由双倒数作图法可得β-半乳糖苷酶在pH值为6.5，37℃时的动力学常数。如图5所示，通过推导可求得米氏常数Km,oNPG=1.15 mmol/L，最大反应速率Vmax,oNP=6.34 μmol/（min·mg）。

3 结 论

由于乳糖酶缺乏导致乳糖不耐受症是目前影响最大的全球性营养代谢障碍之一，因此开发高产β-半乳糖苷酶的益生菌具有重要的应用前景。本文从8株植物乳杆菌中筛选出乳糖酶活力高达6620 U/g的植物乳杆菌K2，并对其产β-半乳糖苷酶性质进行了系统研究。结果表明：植物乳杆菌K2的β-半乳糖苷酶的最适pH为6.5，且此时酶蛋白也最稳定；尽管最适作用温度为60℃，但此温度下酶蛋白很容易失活，而在30℃和40℃时酶蛋白十分稳定；金属离子对β-半乳糖苷酶的酶活有促进或抑制作用，其中Mg2+对β-半乳糖苷酶活力的促进效果最明显，Cu2+则有强烈抑制作用；β-半乳糖苷酶米氏常数Km,oNPG=1.15 mmol/L，最大反应速率Vmax,oNP=6.34 μmol/（min·mg）。研究结果为解决乳糖不耐受症的植物乳杆菌微生态制剂的开发奠定了基础。

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[2]高秀容.乳糖酶的基因克隆[D].西华大学,2006.

[3]KIM J W,RAJAGOPAL S N.Isolation and Characterization of βgalactosidase from Lactobacillus Crispatus[J].Folia Microbiologica,2000,45（1）：29–34.

[4]SCHWAB C,SфRENSEN K I,GÄNZLE M G.Heterologous Expression of Glycoside Hydrolase Family 2 and 42 β-galactosidases of Lactic Acid Bacteria in Lactococcus Lactis[J].Systematic and Applied Microbiology,2010,33（6）：300-307.

[5]毛跟年,李彦军,吴小杰,等.低聚半乳糖的分离纯化[J].食品工业科技,2005（6）：150-151.

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[9]IQBAL S,NGUYEN T H,NGUYEN T T,et al.β-Galactosidase from Lactobacillus Plantarum WCFS1：Biochemical Characterization and Formation of Prebiotic Galacto-oligosaccharides[J].Carbohydrate Research,2010,345（10）：1408-1416.

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Screening of β-galactosidase highly producing Lactobacillus plantarum and its enzymatic properties

GU Yue-hua,ZHANG Jing-sheng,AN Hao-ran,HAO Yan-ling
（College of Food Science&Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing,100083,China）

β-galactosidase can not only be used to solve the problem of lactose intolerance through hydrolysis of lactose in dairy products,but also to synthesize galactooligosaccharides（GOSs）with probiotic function through transgalactosylation reaction.In this paper,Lactobacillus plantarum K2,which could highly produce β-galactosidase,was screened from eight strains of Lactobacillus plantarum.The specific activity of βgalactosidase could reach up to 6620 U/g protein and its enzymatic properties were studied.The results indicated that both of the optimum and most stable pH were 6.5 and the optimum temperature was 60℃while the thermostability was best at 40℃.Mg2+ions could enhance the activity of β-galactosidase obviously,while Cu2+ions had a strong effect of inhibition.The Kmand Vmaxvalues for oNPG were 1.15 mmol/L and 6.34 μmol/（min·mg）,respectively.These results lay a foundation for the development of microecologics of Lactobacillus plantarum,which have the ability to solve the problem of lactose intolerance.

β-galactosidase；Lactobacillus plantarum；enzymatic properties

Q936

A

1001-2230（2012）09-0008-03

2012-01-13

谷月华（1989-），男，硕士研究生，研究方向为食品微生物分子生物学。

郝彦玲