-514 bp及-250 bp位点基因多态性对肝脂酶转录活性的影响

蔡泽园 赵莉莉 张 蕊 毛用敏 崔让庄

-514 bp及-250 bp位点基因多态性对肝脂酶转录活性的影响

蔡泽园 赵莉莉 张 蕊 毛用敏 崔让庄

目的：探讨同时含肝脂酶（HL）启动子-514 bp和-250 bp多态位点的野生型及变异纯合子型的荧光素酶表达质粒对HL转录活性的影响。方法：PCR法扩增含不同目的基因的DNA片段，将目的基因插入到pUCm-T质粒中，获取含SacI及BglⅡ酶切位点的目的基因，将该基因与含荧光素报告基因的pGL2质粒相连，构建pGL2-HL/-514T+-250A变异纯合型以及pGL2-HL/-514C+-250G野生型荧光素酶表达质粒，转染至HepG2细胞内表达，双荧光素酶检测系统检测不同重组质粒荧光素酶报告基因的活性。结果：（1）实验成功构建了同时含HL启动子部位-514/-250位点的野生型和变异纯合型的荧光素酶表达质粒。（2）pGL2-HL/-514T+-250A变异纯合型的荧光素酶相对表达活性明显低于野生型荧光素酶表达活性（P<0.01）。结论：HL启动子-514及-250位置基因的联合变异可直接影响HL的转录活性。

肝脂酶 启动区（遗传学） 多态现象,遗传 杂合子 纯合子 转录,遗传 基因表达

肝脂酶（HL）是脂蛋白代谢的关键酶之一，HL基因启动子区单核苷酸基因多态性与糖尿病、动脉粥样硬化等多种疾病有相关性[1-3]，并与HL活性下降有关，尤其是-514T和-250A等位基因携带者存在HL活性下降的现象[4]。由于HL上述4个位点基因多态性存在着连锁不平衡[5]，本研究拟构建同时含HL基因启动子-514多态性位点与-250多态性位点的重组质粒，转染HepG2细胞，通过检测荧光素酶报告基因的荧光强度，以探讨启动子不同位点的基因变异对转录活性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 Taq DNA聚合酶、大肠杆菌菌株DH5α、pUCm-

Teasy载体、pGL2-Basic载体（上海生工生物工程有限公司）；人肝癌细胞系细胞（HepG2）购自中科院上海细胞库；DMEM培养基（HG-DMEM）、胎牛血清、0.5%胰蛋白酶、青霉素/链霉素（GIBCO公司）；DNA Marker DL2000、T4DNA连接酶、限制性内切酶SacⅠ、BglⅡ（大连宝生物工程有限公司）；胰蛋白胨（天津市东方卫生材料厂）；酵母菌提取物（华美生物工程公司）；细菌琼脂粉、琼脂糖（上海基因科技有限公司）；PCR仪（Gene Amp PCR system 9600）、光度测定计（Eppen⁃dorf公司）；ZF型紫外透射反射分析仪（上海康华生化仪器制造厂）；倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）；层流超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；荧光化学发光测定仪（Applied Biosystems公司）。

1.2 方法 模板：含HL-514C+-250G野生型以及HL-514T+-250A变异纯合子的基因组DNA标本由本室保存。引物：上游 5'-TCTAGGATCACCTCTCAATGGGTCA-3'，下游5'-GGGGTCCAGGCTTTCTTGG-3'，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR扩增体系及参数：25 μL反应体系中各物质的浓度为 300 mmol/L Tris-HCl，75 mmol/L（NH4）2SO4，pH 9.5，12.5 mmol/L MgCl2，20 μmol/L上游引物和下游引物，10 mmol/L dNTP，0.25 μL Taq酶；0.5 μL DNA，反应条件：95 ℃5 min。以下步骤35个循环：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72℃7 min。纯化回收PCR产物，与pUCm-T连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109，碱裂解法提取质粒，限制性内切酶MvaI对重组质粒进行酶切鉴定，进行DNA序列测定（三博远志生物公司）。利用pUCm-T和pGL2-Basic共有的限制性内切酶SacⅠ和BglⅡ酶切pUC-HL/-514C+-250G及pUC-HL/-514T+-250A重组质粒和pGL2-Basic，随后进行连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，限制性内切酶SacⅠ、BglⅡ对重组质粒进行酶切鉴定，并进行DNA序列测定。用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将pGL2-HL/-514C+-250G及pGL2-HL/-514T+-250A重组质粒（1 μg/孔）分别和内参质粒PRL-nuL l（0.025 μg/孔）共转染HepG2细胞（按Lipofectamine 2000操作说明书进行）。细胞转染培养48 h后裂解细胞，收集裂解液，细胞裂解液20 μL与LARⅡ100 μL混合，在荧光发光检测仪读取10 s的发光值，此为萤火虫荧光素酶催化产生的发光强度。再加入Stop＆Glo 100 μL终止萤火虫荧光素酶活性，读取10 s发光值，即为海肾荧光素酶催化产生的发光强度。记录检测数据，计算不同重组质粒荧光素酶相对活性。荧光素酶相对活性的计算公式如下：荧光素酶相对活性=（萤火虫荧光素酶发光强度-空白孔发光强度）÷（海肾荧光素酶发光强度-空白孔发光强度）。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计学处理。计量资料数据以表示，2组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pUC-HL/-514C+-250G及pUC-HL/-514T+-250A重组质粒的构建和鉴定 构建成功的pUC-HL/-514C+-250G及pUC-HL/-514T+-250A重组质粒，经限制性内切酶进行酶切鉴定，由于pUCm-T质粒上有2个MvaI的酶切位点，同时插入的目的片段中亦存在1个MvaI的酶切位点，故正向插入的重组质粒酶切后产生546 bp和212 bp两条片段，见图1。DNA测序显示，重组质粒中含有相应的基因多态性位点，其他序列无变异，pUC-HL/-514C+-250G及pUC-HL/-514T+-250A重组质粒构建成功，见图2。

2.2 pGL2-HL/-514C+-250G及pGL2-HL/-514T+-250A重组质粒的构建和鉴定 构建好的pGL2-HL/-514C+-250G和pGL2-HL/-514T+-250A质粒，用限制性内切酶SacⅠ、BglⅡ进行双酶切，切下与插入片段大小（696 bp）一致的DNA片段，见图3。DNA测序结果显示，重组质粒中含有相应的基因多态性位点，其他序列无变异，pGL2-HL/-514C+-250G和pGL2-HL/-514T+-250A质粒构建成功，见图4。

Figure 1 Electrophoresis of enzyme digestion of pUC-HL/-514+-250 recombinant plasmid DNA图1 pUC-HL/-514+-250重组质粒酶切电泳图

Figure 3 Electrophoresis of enzyme digestion of pGL2-HL/-514+-250 recombinant plasmid图3 pGL2-HL/-514+-250重组质粒酶切电泳图

2.3 荧光素酶报告基因活性检测 pGL2-HL/-514C+-250G质粒中的荧光素酶相对活性高于pGL2-HL/-514T+-250A质粒中的荧光素酶相对活性（9.835±2.462 vs 4.726±1.077），差异有统计学意义（t=4.658，P ＜ 0.01）。

3 讨论

肝脂酶基因启动子区域有4种常见的基因多态性，在不同种族人群中此4个多态性位点几乎成完全连锁不平衡。研究证实，其中的-514T位点与-250位点基因多态性与肝脂酶活性降低及血浆HDL-C浓度变化相关[6-7]。Deeb等[8]通过瞬时转染实验，将含有HL基因启动子-514C与-250G及HL基因启动子-514T与-250A的重组质粒分别转染进人肝癌细胞系HepG2细胞及大鼠的肝细胞系AML12细胞，比较野生型HL基因启动子与-514位点及-250位点均为变异型的HL基因启动子的转录活性，结果显示，2种重组质粒在HepG2细胞中的活性很低以至于很难区分2种重组体的转录活性，可是2种重组质粒在AML12细胞中却表现出很高的活性，HL-514T/-250A的活性比HL-514C/-250G要低30%。目前国内通过瞬时转染实验方法对HL启动子区基因多态性与转录活性的研究尚少见报道。本实验构建了pGL2-HL/-514C+-250G及pGL2-HL/-514T+-250A重组质粒转染入HepG2细胞中以检验两者的转录活性及差别，与Deeb等[8]研究不同的是2种重组质粒在HepG2细胞中都得以高效地表达，分析原因可能是本实验采用了含荧光素酶报告基因的pGL2-Basic载体，而Deeb等采用的是pXP1载体，由于载体不同而导致在同样的细胞内其转录活性却相差巨大。

本研究通过构建pGL2含多态性目的片段的重组质粒并转染入HepG2细胞中，可能为体外研究目的基因启动子多态性与转录功能的关系找到一种有效的途径，但本研究只对HL基因启动子区-514及-250两个位点的多态性与转录活性的关系做了比较，常见的其他两个位点的研究尚有待深入。

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[2]Soyal SM,Sandhofer A,Hahne P,et al.Cholesteryl ester transfer protein and hepatic lipase gene polymorphisms:effects on hepatic mRNA levels,plasma lipids and carotid atherosclerosis[J].Athero⁃sclerosis,2011,216(2):374-380.

[3] Gündogdu F,Gurlertop Y,Pirim I,et al.Association between-514C-->T polymorphism of the hepatic lipase gene and coro⁃nary artery disease in a Turkish population[J].Acta Cardiol，2008,63(2):197-202.

[4]Grarup N,Andreasen CH,Anderson MK,et al.The-250G>A pro⁃moter variant in hepatic lipase associates with elevated fasting se⁃rum high-density lipoprotein cholesterol modulated by interaction with physical activity in a study of 16,156 Danish subjects[J].J Clin Endocrinol Metab，2008,93(6):2294-2299.

[5]Li M,Yin R,Li Y,et al.Association of LIPC-250G>A polymor⁃phism and several environmental factors with serum lipid levels in the Guangxi Bai Ku Yao and Han populations[J].Lipids Health Dis，2010,9(1):28.

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[7]Lindi V,Schwab U,Louheranta A,et al.The G-250A polymor⁃phism in the hepatic lipase gene promoter is associated with chang⁃es in hepatic lipase activity and LDL cholesterol:The KANWU Study[J].Nutr Metab Cardiovasc Dis,2008,18(2):88-95.

[8]Deeb SS,Peng R.The C-514T polymorphism in the human hepatic lipase gene promoter diminishes its activity[J].J Lipid Res，2000,41(1):155-158.

The effect of Hepatic Lipase Gene Promoter Polymorphisms on the Transcriptional Activity

CAI Zeyuan,ZHAO Lili,ZHANG Rui,MAO Yongmin,CUI Rangzhuang

Tianjin Chest Hospital,Tianjin 30051,China

Objective:To investigate the effect of recombinant plasmids containing the double luciferase report gene and the hepatic lipase(HL)promoter-514/-250 sites on HL transcriptional activity.Methods:DNA fragments containing different target genes were amplified by PCR.Target genes were inserted into the plasmid pUCm-T to obtain the target gene containing SacI and BglⅡrestriction sites.The luciferase reporter vectors containing HL promoter-514T/-250A and-514C/-250G polymorphisms were constructed,and tested by Dual Luciferase Reporter Assay System.Results:The lu⁃ciferase reporter vector containing HL promoter-514T+-250A presented higher HL transcriptional activity than that of vec⁃tor with-514C+-250G（P<0.01）.Conclusion:HL promoter-514C together with-250G alleles were associated with high⁃er HL transcriptional activity,which proved that HL promoter polymorphisms can influence the HL transcriptional activity in the molecular mechanism.

hepatic lipase promoter regions(genetics) polymorphism,genetic heterozygote homozygote tran⁃scription,genetic gene expression

10.3969/j.issn.0253-9896.2012.08.016

300051 天津市胸科医院心血管病研究所

（2011-09-01收稿 2011-12-01修回）

（本文编辑 陆荣展）