柱前衍生高效液相色谱法测定胎盘多肽注射液中的氨基酸

黄 莉，吴小曼，纪 宇，王 玉，

(1.中国药科大学，江苏 南京210009;2.江苏省食品药品检验所，江苏 南京 210008)

中医将经过简单的加工炮制后的人胎盘称为“紫河车”，《本草纲目》记载其“味甘、咸、性温”，具有“安神养血、补气、益精、解毒、补血”的作用。此后的中医古籍中均将其作为入药上品，沿用至今［1］，已有数百年历史，且在不断延伸、扩展。

胎盘多肽注射液为无色至淡黄色澄明液体，是健康人胎盘经剔除结缔组织后，捣碎、匀浆、透析、超滤、灭菌而成，主要成分为氨基酸、活性肽、蛋白质、脂质脂肪酸、核酸以及各种生长因子和细胞因子等，主要成分的分子质量为3 000～5 000，能增强细胞的免疫功能，抑制机体的过氧反应，以及促进骨髓造血细胞的生存、增殖、分化及提高生物活性。用于细胞免疫功能降低或失调引起的疾病、手术愈合、细胞性感染引起的疾病及各种原因所致的白细胞减少症等。

目前，胎盘多肽注射液质量控制一般采用测定总氮量的方法，而胎盘多肽注射液作为一种生物提取药物，其成分复杂，仅靠少量指标成分的含量测定并不能对胎盘多肽注射液质量进行有效的控制。通过游离氨基酸和水解后总氨基酸含量的测定，可以从一定程度上反应出胎盘多肽注射液的质量，两者之差还可以计算出注射液中多肽的大致含量。陈柏林等［2］用HPLC Pico-Tag法分析了人胎盘的氨基酸成分，李东浩等［3］用 GC/MS法从胎盘注射液中分离出18个组分，通过计算机检索和人工解析，鉴定出14种氨基酸。他们的衍生方法操作相对复杂，且所用样品大多为自制的胎盘样品，差异较大，不具代表性。6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯(AQC)是一种专门用于氨基酸测定的衍生化试剂，虽然出现的比较晚，但已经被越来越多的人所接受，该方法适用性较强，适合于复杂样品中的氨基酸分析，具有灵敏度高、衍生物稳定等优点。

本实验选用AQC柱前衍生高效液相色谱法，对胎盘多肽注射液进行了包括天门冬酰胺和谷氨酰胺在内的21种常见氨基酸的定量测定。

1 仪器与试药

Agilent 1200 series高效液相色谱仪，配置二极管阵列检测器;KH-250DB型数控超声波清洗器(江苏昆山禾创超声仪器有限公司);LGJ-10型冷冻干燥机(巩义市英峪予华仪器厂);Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。

天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、苏氨酸(Thr)、赖氨酸(Lys)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、蛋氨酸(Met)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Try)、苯丙氨酸(Phe)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、精氨酸(Arg)、天门冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、色氨酸(Trp)和γ-氨基丁酸(GABA)等21种氨基酸对照品，中国药品生物制品检定所;内标α-氨基丁酸(AABA)，美国Sigma公司;AccQ·Fluor衍生试剂盒(包括硼酸缓冲液Buffer 1，衍生剂粉末2A，衍生剂稀释液2B)，美国Waters公司;乙腈为色谱纯;水为去离子超纯水。

胎盘多肽注射液由贵州黔峰生物制品有限责任公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Phenomenex Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱;流动相A为140 mmol/L醋酸铵缓冲液(用冰醋酸调节pH至5.10)，流动相B为乙腈-水(57∶43)，按表1进行梯度洗脱;柱温30 ℃，检测波长248 nm，进样量5 μL。结果表明在此色谱条件下21种氨基酸可以获得良好分离(图1A)。

表1 胎盘多肽注射液的洗脱条件Tab.1 Elution conditions of placenta polypeptide injection

图1 21种混合氨基酸对照品溶液(A)、游离氨基酸(B)和水解后总氨基酸(C)的色谱图Fig.1 Chromatograms of 21 amino acid standards(A)，free amino acids(B)and total amino acids after hydrolysis(C)

2.2 溶液配制

2.2.1 衍生化试剂的制备 精密量取AccQ·Fluor 2B试剂2 mL，加入含衍生化试剂的AccQ·Fluor 2A瓶中，加盖密封，旋涡混合10 s，55℃加热10 min，直至衍生化试剂粉末全部溶解，即得浓度5 mmol/L的AccQ·Fluor衍生试剂，置干燥器中保存备用。

2.2.2 对照品混合储备液 分别取18种氨基酸对照品(Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Arg、Ala、Pro、Tyr、Cys2、Val、Met、Ile、Leu、Lys、Phe 和 GABA)适量，精密称定，置于同一量瓶中，0.1 mol/L盐酸溶液溶解并稀释至刻度，制成浓度均约为5 mmol/L(胱氨酸的浓度约为2.5 mmol/L)的标准储备液，置4℃冰箱中备用。Gln、Asn和Trp储备液使用前，按上述方法另行单独配制，浓度均约为5 mmol/L。

2.2.3 内标溶液 取AABA约25 mg，精密称定，加0.1 mol/L盐酸溶液50 mL溶解，混匀。

2.2.4 游离氨基酸供试品溶液 将胎盘多肽注射液进行冷冻干燥，干燥后称取约一支的重量，加入内标溶液50 μL，加水至1 mL，得到游离氨基酸的供试品溶液。

2.2.5 水解氨基酸供试品溶液 取约两支注射液重量的粉末，加入6 mol/L盐酸溶液2 mL，110℃加热24 h，水解完成后水浴蒸去盐酸，加入内标溶液250 μL 后，加水至5 mL。

2.3 衍生化方法

将上述溶液用0.45 μm滤膜滤过，精密吸取续滤液10 μL，置6 mm ×50 mm样品管中，精密加入AccQ·Fluor中的硼酸缓冲液(Buffer 1)70 μL，涡旋混匀，立即精密加入衍生化试剂20 μL，涡旋反应30 s，用封口膜密封样品管，室温放置1 min，于55℃加热20 min，即得。

2.4 线性与检出限

分别取混合储备液和新制备的Gln、Asn和Trp对照品溶液适量，加入内标溶液适量，制成各种氨基酸浓度均约为 0.005，0.01，0.02，0.05，0.10，0.25，0.50 mmol/L的混合标准溶液。按2.3项下方法进行衍生化，按2.1项下色谱条件进行测定。以各种氨基酸峰面积与内标峰面积之比为纵坐标Y，各氨基酸浓度(换算成mg/L)为横坐标X，进行线性回归，结果见表2。结果表明，21种氨基酸在0.50～0.005 mmol/L范围内与峰面积比具有良好的线性关系。将标准混合溶液逐步稀释后以S/N=3确定检出限，得到21种氨基酸的检出限均小于1.57 ng(表2)。

2.5 重复性及稳定性试验

取同一份供试品溶液，进行衍生化反应和色谱分析，分别在0，2，4，8，12 和 24 h 进样，根据各氨基酸色谱峰峰面积与内标峰峰面积比值，计算RSD，以考察样品溶液的稳定性，21种氨基酸稳定性试验RSD均小于4.50%。另取同一批胎盘多肽注射液6份，进行衍生化反应和色谱测定，根据各种氨基酸的色谱峰峰面积与内标峰峰面积比值，计算RSD，以考察方法的重复性，21种氨基酸峰重复性试验RSD均小于4.15%(n=6)。

表2 21种氨基酸的线性方程及检出限Tab.2 Regression equations and LOD of 21 amino acids

2.6 回收率试验

取已知含量的供试品，平行6份，精密称定，分别精密加入0.10 mmol/L氨基酸对照溶液0.50 mL，进行衍生化反应并测定含量，计算各种氨基酸的加样回收率，结果见表3，平均回收率在82.8% ～112.8%，RSD在1.70% ～14.0%。

2.7 游离氨基酸的测定结果

取三批游离氨基酸供试品溶液各两份，进行衍生化反应，分别取5 μL，注入色谱仪，进行测定，得到游离氨基酸的色谱图(图1B)，测定结果见表4。

2.8 水解总氨基酸的测定结果

取三批水解氨基酸供试品溶液各两份，进行衍生化反应，分别取5 μL，注入色谱仪，进行测定，得到水解后氨基酸的色谱图(图1C)，测定结果见表5。

3 讨论

酰胺类氨基酸的检测历来是分析的难点［4］，本法在经典的AQC衍生化氨基酸分析方法的基础上进行改进，只需精确控制缓冲液的pH值即可。在色谱分离过程中有三个关键色谱峰对，其中Glu和Asn峰对对pH变化很敏感，当pH值由5.00改变为5.10时，Glu和Asn峰对由相互重叠逐渐达到完全分离，而His和Gly、NH3和Ala峰对的分离略受影响;同时NH3和Ala峰对有机相比例变化较敏感，通过试验将有机相组成确定乙腈-水(57∶43)。这三组峰对的保留时间均比较小，先以较小流速洗脱再增加流速，可进一步改善分离效果，使三组峰对均能达到基本分离。

表3 21种氨基酸的加样回收率(n=6)Tab.3 Recoveries of 21 amino acids added(n=6)

表4 游离氨基酸的测定结果Tab.4 Results of determination of free amino acids

表5 水解总氨基酸的测定结果Tab.5 Results of determination of total amino acids after hydrolysis

氨基酸测定结果表明，胎盘多肽注射液的游离氨基酸和水解氨基酸含量非常接近，仅个别氨基酸水解后含量略有增加，根据计算可以大致推断，胎盘多肽注射液中的多肽含量为4～20 μg/mL。此含量低于文献报道的50 μg/mL［5］，可能是由于取样量太少导致的误差，也有可能是不同批次生产工艺的差别导致的。为了深入探究其原因，将这3批胎盘多肽注射液分别用福林酚法和双辛可宁酸(BCA)法［5］进行测定，得到其多肽的含量约为 50 μg/mL。为了验证胎盘多肽注射液中的游离氨基酸是否对比色法的结果有干扰，依照AQC法测定的游离氨基酸含量自行配制了一份氨基酸混合对照品溶液，也采用福林酚法和BCA法进行测定，发现该氨基酸混合对照品溶液的吸光度值约均占总吸光度值的30%左右，故样品中的游离氨基酸对比色法的测定结果有干扰。又由于胎盘多肽注射液是由胎盘提取液制得，成分较复杂，其中很可能还有其他物质对比色法的测定结果有干扰。故比色法的专属性不强，多肽的含量用AQC法衍生高效液相色谱法测定比较合理。

［1］ 杨桂琴，邹兴淮.胎盘及其提取物的化学成分、药理作用及临床应用研究进展［J］.沈阳农业大学学报，2003，34(2):150-154.

［2］ 陈柏林，郭 敏，陈莉娟.HPLC Pico-Tag法分析人胎盘的氨基酸成分［J］.营养学报，1996，18(4):480-482.

［3］ 李东浩，姚艳红.胎盘注射液中氨基酸的GC/MS测定［J］.延边大学学报:自然科学版，1995，21(3):25-28.

［4］ Van Wandlen C，Cohen S A.Using quaternary high-performance liquid chromatography eluent systems for separating 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate-derivatized amino acid mixtures［J］.J Chromatogr A，1997，763:11-15.

［5］ 张云楚，纪 宇.双辛可宁酸法测定胎盘多肽注射液中低浓度多肽的含量［J］.中国生化药物杂志，2010，31(6):402-404.