重组降血压肽缓释微球的制备与体外释放

孙海燕，罗菊珍，刘 冬

(深圳职业技术学院，广东 深圳 518055)

降血压肽(antihypertensive peptide，AHP)是一类与血管紧张素转化酶抑制剂具有相同降压机制的小分子多肽，由于降血压效果显著且无毒副作用，因而成为一种极具开发潜力的多肽类抗高血压药物［1］。本实验室已成功利用基因工程技术高效制备出重组降血压肽(recombinant antihypertensive peptide，rAHP)。动物试验表明，自发性高血压大鼠(SHR)给rAHP 2 h后，收缩压显著降至最低，12 h后血压恢复到给药前水平，降压效果呈现较为明显的“峰谷”波动，不利于高血压患者的平稳降压［2-3］;利用Caco-2模型对其吸收机制的研究表明，rAHP主要以旁路转运方式被小肠上皮细胞吸收，生物利用度在1%以下［4-5］。为提高rAHP的生物利用度、延长药物作用时间和平稳降压，本研究选用可生物降解的聚乳酸(PLA)为载体材料，利用复乳-液中干燥法研制rAHP缓释微球，通过微球配方设计、优化制备工艺及对体内外释放特性和降压效果的评价，以期开发出具有临床应用价值的rAHP缓释新制剂。

1 材料

rAHP(序列为VLPVPR)，本实验室通过基因工程方法制得，纯度≥99%;聚乙烯醇124(PVA)，国药集团化学试剂有限公司;PLA(黏均分子质量80 000)，本院精细化工实验室提供;乙腈和三氟乙酸为色谱纯;其他试剂均为市售分析纯。

LC 20-A高效液相色谱仪，日本岛津公司;ALPHA 2-4真空冷冻干燥机，德国 CHRIST公司;H550S显微照相系统，日本 Nikon公司;IX71-A21PH倒置显微镜，日本Olympus公司;S3500激光粒度分析仪，美国Microtrac公司。

2 方法

2.1 微球的制备

采用复乳-液中干燥法制备［6］。将适量 rAHP溶解于水中作为内水相，PLA溶解于二氯甲烷作为油相，两者在冰浴中高速机械搅拌5 min得W1/O初乳。在800 r/min磁力搅拌下将初乳倒入一定浓度的PVA溶液100 mL中，搅拌10 min，得到W1/O/W2复乳。在25℃下继续搅拌5 h，挥发有机溶剂固化微球，离心洗涤后冷冻干燥得到rAHP微球。

2.2 rAHP的测定

采用高效液相色谱(HPLC)法［7］测定。

2.2.1 色谱条件 色谱柱:VYDAC 238EV54 C18(200 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈-水-三氟乙酸(17∶83∶0.05);流速:1.0 mL/min;检测波长:199 nm;柱温:30 ℃;灵敏度:0.01AUFS;进样量:20 μL。

2.2.2 标准曲线的制备 称取适量rAHP，用水配制成 25，125，250，375，500 和 625 μg/mL 的标准溶液。测定rAHP的峰面积，以浓度(C)与峰面积(A)作线性回归。回归方程为:A=2.668×106C+9.302×104，r=0.999 9，可见，rAHP 在25 ～625 μg/mL 浓度范围内与峰面积线性关系良好。最低检测浓度为12 ng/mL。

2.3 微球包封率和载药量的测定

2.3.1 包封率测定 微球冻干后，加水适量分散，离心，上清液加水至50 mL，HPLC法测定，记录色谱图，量取峰面积，由标准曲线，计算出上清液中游离rAHP的量，并计算包封率［8］。包封率=(投药量-游离药量)/投药量×100%。

2.3.2 载药量测定

2.3.2.1 校准曲线的制备 用空白微球的二氯甲烷溶液(空白微球10 mg/mL)配制成浓度分别为25，50，100，200，250 和 500 μg/mL(真实值)的rAHP溶液，分别取1 mL，加水3 mL萃取，各萃取3次，合并萃取液，HPLC法测定，记录色谱图，量取峰面积，由标准曲线计算萃取液中rAHP含量(测量值)。以真实值(X)对测量值(Y)进行线性回归，得微球载药量校准曲线方程:Y=0.960 9 X+0.000 6，r=0.999 4。

2.3.2.2 测定方法 准确称取载药微球10 mg，用二氯甲烷1 mL溶解，然后加水3 mL萃取，萃取3次，合并萃取液，加水至50 mL，HPLC法测定，记录色谱图，量取峰面积，根据标准曲线计算萃取液中rAHP含量，然后根据校准曲线计算微球中rAHP的真实含量，计算载药量［8］。载药量=(微球中药物含量/微球干重)×100%。

2.4 微球粒径及粒径分布测定

取微球适量，加水分散，用激光粒度分析仪测定微球的粒径和粒径分布。粒径分布用跨度(Span)表示［6］。跨度值越小，粒度分布越窄，微球越均匀。

2.5 微球制备工艺优化

根据单因素实验结果，确定油相中PLA的浓度(CPLA)、初乳搅拌速度(Vstir)、内水相与油相体积比(Rw/o)以及外水相PVA浓度(C'PVA)等对微球特性影响最大，以此四个因素进一步做L9(34)正交实验优化(见表1)。

表1 L9(34)正交实验因素水平表Tab.1 Orthogonal experiment at L9(34)

用包封率(S1)、微球得率(S2)、粒径分布跨度(S3)为指标对微球进行评价，其中包封率、得率都是越大越好，跨度则越小越好。采用归一化法，把这S1、S2和S3三个指标转化为综合评价指标 S［6］。

2.6 微球的体外释放度试验

分别精密称取微球10 mg，置10 mL具塞离心管中，加入pH为7.4的磷酸缓冲液(含0.02%叠氮化钠)5 mL，密封，于37℃水浴中低速恒温震荡，震荡频率为50次/min，前2天选取开始后的0.5，2，8，16，24和48 h为取样点，第3天后的每一天都在同一时间点取样一次，取样时每支离心管800 r/min离心2 min，取上清100 μL，用HPLC法检测上清液中rAHP的含量，并计算释放度。取样后离心管中分别补加磷酸缓冲液100 μL，继续恒温震荡。

3 结果与讨论

3.1 微球制备工艺优化结果

正交试验结果见表2。结果表明，微球制备的最优工艺为:油相中PLA的浓度为7.5%、初乳搅拌速度为900 r/min、内水相与油相体积比为1∶10，外水相PVA浓度为5%。此时综合评价指标S值最大。

表2 微球制备正交试验结果(n=3)Tab.2 The results of orthogonal experiments(n=3)

3.2 优化工艺所得rAHP-PLA微球的特性

按优化后的处方和工艺制得3批微球，所制备载药微球的包封率为(81.35±1.30)%，载药量为(10.92±0.37)%，微球得率为(80.26±2.35)%，3批微球的平均粒径分布范围在75～80 μm之间，跨度小，粒径分布比较均匀。显微照相系统下拍得的微球照片如图1所示。可以看出，微球呈白色粉末状，表面光滑，成球圆整，分散性好，大小均匀，没有明显聚集现象。微球的粒径累积分布图见图2，结果显示微球的平均粒径分布范围在75～80 μm之间。

图1 优化工艺所得rAHP-PLA微球在显微照相系统下的照片Fig.1 Pictures of the rAHP-PLA microspheres made by optimal preparation technology

图2 微球的粒径分布图Fig.2 The particle diameter distribution of the microspheres

3.3 优化工艺所得rAHP-PLA微球的体外释放度

rAHP-PLA缓释微球的15 d内体外释药情况见图3。从释放曲线可以看出，rAHP缓释微球的释药过程主要分为四个阶段:第一阶段是前24 h，此阶段是快速释放期，累积释放率达到49.5%。此阶段主要是微球表面或近表面存在的药物溶解在释放介质中，及通过微球孔洞直接释放出来的药物［9-11］。24～144 h期间是微球体外释放的第二阶段，即释放延缓期，这一期间对应的曲线走向很平缓，即微球平缓释放，累积释放率只提高了约十个百分点，其原因可能是微球的体外释放处于药物的扩散过程，即药物从微球经水解形成的多孔结构内扩散或缓慢迁移，因而释放平缓。第三阶段是在144～240 h期间，这是加速释放期。在这期间曲线走势又开始迅速攀升，表现为微球的累积释放率从61.6%迅速上升到91.4%以上，上升了30个百分点。这一阶段随着PLA的不断水解，其分子质量会逐渐降低到某一限度，这样就导致了骨架溶蚀效应的出现［12-13］。此时，PLA微球的骨架松散，水分大量渗入，致使微球的释药速率加快。第四阶段是240 h后的缓慢释放阶段，此阶段药物一直处于缓慢速度释放，其原因可能是当微球经过溶蚀效应而导致骨架崩溃后，崩溃的骨架里残留的少量药物(10%以下)由于浓度低而缓慢溶解释放于介质中。

4 结论

本文以PLA为材料，探讨了制备rAHP缓释微球的可行性。结果表明，按最优工艺和配方制备的rAHP微球包封率为81.35%，载药量为10.92%，微球得率为80.26%。所制得的微球表面光滑圆整，分散性良好，粒径的平均分布范围在75～80μm之间，跨度小，粒径分布比较均匀。

体外释药试验显示，rAHP-PLA缓释微球的释药过程包括0～24 h内的快速释放期、24～144 h内的缓慢释放期、144～240 h内的加速释放期及240 h后缓慢释放期四个阶段。其中在前0.5 h药物累积释放率为17.5%，360 h累积释放率达到98.6%，满足我国药典对缓释制剂的指导原则要求［14］，适合于进一步开发为符合临床治疗需要的中长效注射制剂。本研究为解决多肽药物应用的瓶颈，促进降血压肽的临床使用提供了重要的实验基础。

图3 载药微球的体外释放情况Fig.3 The release of the rAHP-PLA microspheres in vitro

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