氯吡格雷与肝素合用抑制大鼠动脉粥样硬化

陈斗仁，杜莉婷

(1.江苏省淮安市第二人民医院 制剂室，2.南京医药天颐分公司，江苏 淮安 223002)

冠状动脉发生粥样硬化病变过程中，硬化斑块发生破裂、胶原暴露、血小板激活发生黏附聚集、引起血栓形成［1］，导致冠状动脉血管发生闭塞性或者非闭塞性血栓形成，因此抗凝和抗血小板治疗非常重要［2］。近年来国内外对单独使用氯吡格雷或氯吡格雷联合其他抗血小板药物抑制动脉粥样硬化做了很多研究，但氯吡格雷联合肝素对动脉粥样硬化的影响鲜有报道。本文研究了抗血小板药物氯吡格雷联合抗凝药肝素对实验性动脉粥样硬化的影响。

1 材料

氯吡格雷，武汉大华伟业医药化工集团;肝素，黄山市屯溪区诚义生物再生制品厂;胆固醇，上海晶纯实业有限公司;胆酸钠，上海晶纯实业有限公司;丙基硫氧嘧啶，湖北健源化工有限公司;维生素D3注射液，江苏吴中医药集团有限公司。

血脂测定试剂盒，北京市斑珀斯技贸有限责任公司;血清C反应蛋白(CRP)测定试剂盒，Sigma公司;巨噬细胞单克隆抗体RAM11，Denmark公司;大鼠平滑肌肌动蛋白单克隆抗体1A4，Sigma公司;免疫组织化学Power VisionTM-PV6002试剂盒，PowerVision。

雄性SD大鼠，体质量250 g，南京军区总医院实验动物中心提供，动物合格证号:SCXK(军)2007-004。

2 方法

2.1 模型建立与分组给药

SD大鼠，随机分为5组:正常对照组、模型对照组、肝素组、氯吡格雷组、氯吡格雷与肝素合用组，每组15只。正常对照组给予正常饲料喂食80 d，其余4组给予高脂饲料(3%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%猪油、81.3%基础饲料)喂食80 d，同时在给予饲料前，腹腔注射维生素D3注射液60万单位/kg。对照组给予同体积的生理盐水。每周记录体质量［3］。另外，肝素组灌胃给予肝素10 mg/(kg·d)、氯吡格雷组灌胃给予氯吡格雷3 mg/(kg·d)、氯吡格雷与肝素合用组灌胃给予肝素10 mg/(kg·d)和氯吡格雷3 mg/(kg·d)。

2.2 血脂和CRP含量测定

血清中血脂含量测定采用酶联免疫法，指标包括总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)。在第80天，取静脉血利用固相酶联免疫吸附法测血清CRP含量。

2.3 病理学观察

在80 d后，处死大鼠，摘取主动脉5 mm，并取肝脏横断面，用10%福尔马林固定，HE染色后观察主动脉壁斑块沉积情况。

2.4 免疫组织化分析

采用免疫组化SP法，按试剂盒说明操作，以药盒提供的阳性片为阳性对照，用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗为阴性对照。采用显微-电脑图像分析系统计算阳性细胞百分数。

2.5 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件。组间比较用卡方检验或t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 血脂含量与体重

80 d后，各组大鼠的体质量比试验开始时显著增加(P＜0.05)，但各组之间无统计学差异(P＞0.05);4组高胆固醇饲料组动物的血清中TC、LDLC、TG水平均显著升高(P＜0.05)，且明显高于正常对照组(P＜0.05)，说明动脉粥样硬化大鼠实验模型建立成功。肝素组与模型对照组相比，TC、TG水平显著降低(P＜0.05)，氯吡格雷组与模型对照组相比无统计学差异(P＞0.05)，合用组血脂水平与模型对照组相比，TC、TG水平显著降低(P＜0.05)。肝素组、合用组与模型对照组相比，HDL-C水平有 上升趋势，但无统计学差异。见表1。

表1 各组大鼠血脂含量的比较(n=15，±s)

表1 各组大鼠血脂含量的比较(n=15，±s)

与0时比较:1P＜0.05;与正常对照组比较:2P＜0.05;与模型组比较:3P＜0.05

组 别 时间/d 体质量/kg TC/(mmol/L) TG/(mmol/L) HDL-C/(mmol/L)LDL-C/(mmol/L)正常对照组 0 0.25±0.06 0.79±0.29 1.82±0.55 0.79±0.15 0.95±0.64 80 0.55±0.051 0.82±0.411 1.94±0.821 0.78±0.21 0.85±0.821模型对照组 0 0.25±0.10 0.80±0.43 1.79±0.35 0.82±0.18 1.23±0.29 80 0.59 ± 0.041 2.25 ± 0.441，2 55.45 ± 8.651，2 0.70 ± 0.15 51.84 ± 8.331，2肝素组 0 0.25±0.06 0.81±0.34 1.81±0.23 0.81±0.14 0.95±0.51 80 0.43 ± 0.211 1.34 ± 0.801，2，3 32.89 ± 5.541，2，3 0.77 ± 0.15 40.19 ± 5.261，2，3氯吡格雷组 0 0.26±0.06 0.79±0.25 1.81±0.54 0.74±0.23 0.97±0.48 80 0.58 ± 0.131 1.64 ± 0.131，2 38.9 ± 12.121，2 0.70 ± 0.14 47.60 ± 11.961，2合用组 0 0.26±0.06 0.84±0.11 1.80±0.54 0.79±0.16 1.30±0.47 80 0.42 ± 0.121 1.20 ± 0.981，2，3 31.82 ± 8.891，2，3 0.78 ± 0.13 37.05 ± 8.601，2

3.2 CRP含量

肝素组、氯吡格雷及合用组中血清CRP浓度分别为177，189和141 μg/L，均高于正常对照组(80 μg/L)(P ＜0.05)，但明显比模型对照(267 μg/L)组低(P＜0.05)。肝素组和氯吡格雷组之间无统计学差异(P＞0.05)。合用组与肝素组、氯吡格雷组相比虽然无统计学差异(P＞0.05)，但有进一步降低的趋势。

3.3 主动脉及免疫组织学变化

正常对照组组主动脉内膜平整光滑，而模型对照组主动脉管腔直径变小，内膜明显变厚，内膜表皮大量平滑肌细胞增生，脂质斑块弥漫，可见泡沫细胞积聚，斑块底部泡沫细胞发生变性坏死，内弹力层与中弹力板发生变性、断裂和崩解，在内膜和中膜均出现了大量的斑块和炎细胞浸润，肝素组、氯吡格雷组及合用组的病变程度相对模型对照组有所减轻。药物干预组的斑块内膜面积比、内膜厚度、内膜中膜厚度比与模型对照组相比显著降低(P＜0.05)，且合用组的斑块内膜面积比、内膜厚度、内膜中膜厚度比与肝素组、氯吡格雷组相比明显降低，有统计学差异(P＜0.05)。动脉粥样硬化斑块中的主要组成细胞是巨噬细胞。肝素组、氯吡格雷组及合用组中巨噬细胞含量与模型对照组相比，明显减少(P＜0.05)。合用组组与肝素组、氯吡格雷组相比有显著差异(P＜0.05)，肝素组与氯吡格雷组之间无显著性差异(P＞0.05)。见表2。

表2 氯吡格雷、肝素及合用对大鼠主动脉组织的影响(n=15，±s)

表2 氯吡格雷、肝素及合用对大鼠主动脉组织的影响(n=15，±s)

与模型对照组比较:1P＜0.05;与肝素组比较:2P＜0.05;与氯吡格雷组比较:3P＜0.05

组别 斑块、内膜面积比/% 内膜厚度/μm 内膜中膜厚度比/% 巨噬细胞/%模型对照组 93.33±10.11 142.67±1.22 51.15±11.23 57.90±1.22肝素组 67.09±9.541 86.67±3.451 29.82±3.231 41.00±3.451氯吡格雷组 67.65±5.451 64.89±4.541 24.69±5.481 40.93±4.541合用组 31.64 ± 3.211，2，3 34.22 ± 2.321，2，3 13.85 ± 0.651，2，3 24.33 ± 2.321，2，3

4 讨论

本研究采用喂食高胆固醇饲料诱导大鼠动脉粥样硬化模型，研究肝素与氯吡格雷及两药联合使用对大鼠动脉粥样硬化病变的作用。结果显示，肝素能明显降低血清中TC、TG的水平，而氯吡格雷对血脂水平影响不大，但两药合用能明显降低降低血清中TC、TG的水平。这可以说明氯吡格雷抑制动脉粥样硬化与血脂水平无关，肝素抑制动脉粥样硬化与血脂水平有关。本研究还显示，肝素与氯吡格雷可使血清CRP浓度降低，且联合用药有进一步降低的趋势。氯吡格雷与肝素减小斑块面积、抑制内膜增生的作用相当，两药联合使用后作用显著增强。免疫组织化学结果显示，肝素、氯吡格雷及两药合用均使斑块中巨噬细胞数减少，提示抗血小板药物可能通过抑制巨噬细胞的迁移和增殖，减轻了动脉局部炎症反应。

肝素促使释放的脂酶，可降解乳糜微粒中的TG，同时使载体蛋白和游离胆固醉转变成高密度脂蛋白，高密度脂蛋白能防止胆固醇在末梢组织沉积并对低密度所致的血管内皮损伤有抑制作用，同时肝素能够加强抗凝血酶Ⅲ对凝血因子Ⅹa的灭活，从而影响凝血过程［4］，再者低分子肝素有保护血管内皮细胞作用。所以肝素能抑制动脉粥样硬化。应用氯吡格雷联合肝素抑制动脉粥样硬化，优于单独使用氯吡格雷。

［1］ Huo Y Q，Schober A，Forlow S B，et al.Circulating activated platelets exacerbate atherosclerosis in mice deficient in apolipoprotein E［J］.Nat Med，2003，9(1):61-67.

［2］ Corsetti J P，Rainwater D L，Moss A J，et a1.High lipoprotein-associated phospholipase A2 is a risk factor for recurrent coronary.E-vents in postinfarction patients［J］.Clin Chem，2006，52(7):1331-1338.

［3］ 周永刚，蓝晓红.动脉粥样硬化大鼠实验模型的建立与评价［J］.解放军药学学报学报，2011，27(5):399-401.

［4］ 刘军妮，徐冬玲.血清脂蛋白相关磷脂酶A2与冠状动脉粥样硬化斑块稳定性的相关研究［J］.2009，40(1):18-21.