银杏叶提取物对大鼠肺成纤维细胞表达CTGF和α-SMA的影响

李 铭，袁保东，廖 红，程恒辉

(1.武汉市结核病防治所，湖北 武汉 430030;2.武汉市商业职工医院，湖北 武汉 430021;3.华中科技大学 同济医学院 附属同济医院病理研究所，湖北 武汉 430030)

近年来细胞因子在肺纤维化中的作用日益受到重视，结缔组织生长因子(CTGF)作为转化生长因子-β1(TGF-β1)的下游介质，对促进肺成纤维细胞表型转化具有更强、更直接的作用［1］。已有研究表明，银杏叶提取物(GBE)对肝、肾纤维化具有一定预防作用［2］，但对肺纤维化的作用报道甚少。本研究观察GBE对肺纤维化大鼠肺成纤维细胞表达CTGF和肌成纤维细胞的标志产物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的影响，为肺纤维化防治提供依据。

1 材料

GBE注射液(5 mL∶17.5 mg，德国威玛舒培博士大药厂，进口药品注册证号:BX20010117);RPMI 1640培养基(Gibco公司);小牛血清(杭州四季清生物工程有限公司);CTGF抗体(美国Santa Cruz公司);α-SMA抗体(武汉博士德生物工程有限公司)。

ALTRATM型流式细胞仪(美国贝克曼库尔特有限公司)。

健康清洁级雄性SD大鼠4只，体重(220±30)g，武汉大学动物实验中心提供，合格证号:SCXK鄂2010-0003。

2 方法

2.1 细胞培养及分组

大鼠气管内一次性滴注5 mg/kg博来霉素A5后14 d，将大鼠麻醉后处死，低温下取出肺脏，组织块法原代培养肺成纤维细胞，24 h内贴壁细胞即为肺成纤维细胞，细胞鉴定采用免疫细胞化学法(SP法)检测Vimentin表达。添加含有10% 小牛血清的RPMI 1640培养基，置于37℃、5%CO2培养箱。5～7 d后传代，选择第4代细胞用于试验。细胞分组:对照组、GBE 高、中、低剂量(25，50，100 mg/L)组，分别加入相应浓度的GBE共培养24 h。

2.2 SP法检测CTGF

制备细胞爬片，常规SP法检测成纤维细胞表达CTGF，用图像分析仪行半定量分析，每一玻片任选5个视野检测细胞积分光密度值，获得平均积分吸光度值［3］。

2.3 流式细胞术检测α-SMA

胰蛋白酶消化第4代细胞，用4℃的75%乙醇溶液固定，每份样品含5×105个细胞，采用流式细胞仪检测α-SMA值，检测单个成纤维细胞表达α-SMA的水平。

2.4 统计学分析

3 结果与讨论

GBE对大鼠肺成纤维细胞表达 CTGF和 α-SMA的影响见表1。25 mg/L GBE组CTGF和α-SMA表达与对照组比较无明显差异;50和100 mg/L GBE组CTGF和α-SMA的表达均明显低于对照组;100 mg/L GBE组表达低于50 mg/L组(P＜0.05)。

近年研究表明，成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，合成大量胶原等细胞外基质成分，同时细胞外基质降解减少是肺纤维化发生的主要原因［4］。α-SMA是成纤维细胞表型向肌成纤维细胞分化的标志。银杏叶的主要成分为黄酮类和内酯化合物，具有清除氧自由基的作用［5］。

表1 GBE对大鼠肺成纤维细胞表达CTGF和α-SMA的影响

本研究结果提示，GBE对纤维化大鼠肺成纤维细胞转化为肌成纤维细胞具有一定抑制作用。GBE是一种天然活性物质，其有效成分为黄酮甙及银杏内酯，黄酮甙具有明显的抗氧化和自由基清除活性。而肺纤维化进程中，氧自由基生成过多导致NO等大量生成是肺纤维化形成的促发因素之一，所以推测GBE对肺纤维化大鼠肺成纤维细胞表型转化的抑制作用可能与其清除一氧化氮等自由基有关。总之，GBE对肺纤维化大鼠肺成纤维细胞表型转化具有一定抑制作用，其具体机制还有待进一步研究。

［1］ 雷贤华，鲍 敏，甄海宁.肿瘤坏死因子-α对大鼠肺成纤维细胞表达结缔组织生长因子的影响［J］.中国生化药物杂志，2010，31(5):340-342.

［2］ 李相军，王 丹，石 艳，等.银杏叶提取物对体外培养大鼠肾成纤维细胞作用的实验研究［J］.中国实验诊断学，2010，14(1):45-47.

［3］ 陈 琳，魏路清.阿托伐他汀对TGF-β1诱导的大鼠肺成纤维细胞分化的影响［J］.武警医学院学报，2009，18(2):93-96，100.

［4］ 谭明旗，董晨光，魏路清，等.阿托伐他汀对转化生长因子β1诱导的大鼠肺肌成纤维细胞分化的影响［J］.中国医科大学学报，2008，37(4):505-508.

［5］ 潘尚领，刘承武，黄龄瑾，等.银杏叶提取物对人胚肺成纤维细胞氧化应激的保护作用［J］.中国老年学杂志，2007，27(12):1128-1130.