亚慢性砷暴露对雄性小鼠脑组织性基因Eif2s3y表达的影响

王 琪，朴丰源

(1. 中国医科大学 96期临床医学班，辽宁 沈阳 110001；2. 大连医科大学 劳动卫生与环境卫生学教研室，辽宁 大连 116044)

砷是一种广泛存在的环境污染物。急、慢性砷暴露可导致生殖系统、消化系统、泌尿系统、心血管系统、神经系统、皮肤等多组织器官的损害，严重危害人类的健康。近年来，砷对男性生殖系统的毒性作用备受关注[1-2]。Hsieh等[1]通过流行病学调查和临床观察发现砷对男性生殖系统有一定的毒性作用。Chiou等[2]通过实验研究发现砷可损害实验动物的精子生成功能，导致雄性生殖系统功能异常。以上文献均提示，男性生殖系统可能是砷毒性作用的主要靶器官之一，但其毒作用机制并不十分清楚。目前认为编码于Y染色体的性基因参与调节雄性生殖功能。本课题组在近期动物实验研究中发现，砷暴露显著影响一些性基因的表达[3-4]。Eif2s3y是Y染色体性基因，不仅在雄性生殖系统中表达，在脑组织中也有高表达，与精子的发育调控密切相关[5-6]。因此，本研究就亚慢性砷暴露对雄性小鼠脑组织Eif2s3y表达影响进行观察，以便为探讨砷的雄性生殖毒作用机制提供靶基因依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

三氧化二砷(As2O3)；TRIzol 试剂盒(美国Invitrogen公司)；RNeasy Mini Kit(德国OIAGEN公司)； DEPC-Water (美国Ambion公司)； Herring Sperm DNA (美国Promega公司); BSA(美国Invitrogen公司); MOPS (上海Sagon公司); β-Mercaptoethanol (上海Sagon公司); Normal Goat IgG (美国Sigma公司)； 氯仿(天津市福晨化学试剂厂)；异丙醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)；乙醇(沈阳新兴试剂厂)；TRNzol-A+总RNA提取试剂(天根生化科技有限公司)；Quant cDNA 第一链合成试剂合(天根生化科技有限公司)；2×Taq PCR MasterMix(天根生化科技有限公司)。

1.2 设 备

GeneArrayTM扫描仪3000(Affymetrix公司)；全自动芯片洗涤工作站450 (Affymetrix公司)；基因芯片杂交箱640(Affymetrix公司)；Microarray Suite Version 5.0分析软件(Affymetrix公司)等；754紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)； PCR仪(Thermo Electron Co,美国)；UVP凝胶电泳拍摄分析系统(美国UVP公司)。

1.3 实验动物及处理

SPF级雄性小鼠30只，体重(20±2)g，由大连医科大学实验动物中心提供。按体重将小鼠随机分为3组，即生理盐水对照组、低剂量组染砷组(1 mg/L As2O3和高剂量组染砷组(4 mg/L As2O3)，每组10只。小鼠正常饮食，通过自然饮用含不同浓度As2O3蒸馏水的方式使小鼠染毒，连续染毒60 d。染毒结束后，将小鼠断头处死并立即取脑储存于RNA lazer 液中，低温保存。

1.4 总RNA的提取和基因芯片杂交

分别将各实验组(1 mg/L和4 mg/L As2O3)和对照组的小鼠大脑和小脑在液氮中进行研磨，依TRIzol 试剂盒操作说明从脑组织中抽提总RNA，用RNeasy Mini Kit进行纯化。提取的RNA在紫外分光光度仪下测定RNA的浓度和纯度，同时变性胶电泳检测RNA有无降解；然后反转录成cDNA，用RNA转录标记试剂盒进行体外转录合成cRNA探针，合成的同时进行生物素标记；生物素标记的cRNA探针经片段化处理后与Mouse Genome 430 2.0 Araay基因芯片在杂交箱640中45℃杂交16 h，然后于全自动芯片洗涤工作站450中洗脱、染色；最后用GeneArrayTM 扫描仪3000扫描杂交信号。

1.5 芯片数据处理和生物学信息分析

杂交结果用Affymetrix公司的Microarray Suite Version 5.0软件进行分析。在对单个样本表达分析的前提下，根据P<0.04为表达，0.04～0.06为临界，P>0.06为不表达，分别建立对照组、低剂量染砷组，高剂量染砷组脑组织的基因表达谱；然后将二者的基因表达谱进行比较，根据signal log ratio (SLR)值判断。SLR>1(即表达倍数>21)为表达上调，SLR<-1(即表达倍数<2-1)为表达下调，筛选得到在对照组、低剂量染砷组，高剂量染砷组中差异表达的基因探针号输入NetAffy网站(www.affymetrix.com)中进行批量处理查询(Batch Query)，查询出相对应的基因和生物学信息。

1.6 RT-PCR

按试剂盒说明提取总RNA。RT- PCR 反应条件为，Eif2s3y为: 94℃变性3 min,94℃变性30 s,55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环，72℃充分延伸7 min；β-actin：94 ℃变性3 min,94℃变性30 s,58 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环，72℃充分延伸7 min。 RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统照相。同β-actin比较。引物设计见表1。

表1 引物设计Tab1 Primer design

1.7 统计学方法

用SPSS12.0统计软件进行分析。用方差和LSD检验分析PCR检测的mRNA表达相对值的多组间差异,以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 染砷组小鼠脑组织Eif2s3y基因芯片筛选结果

在小鼠大脑和小脑中，与对照组比较，高剂量染砷组和低剂量染砷组Eif2s3y基因表达均上调。见表2。

表2 染砷小鼠脑组织Eif2s3y基因表达的芯片结果

与对照组比较，染砷组小鼠脑组织基因表达显著上调(表达倍数>2)。

2.2 染砷小鼠大脑皮质Eif2s3y的 RT-PCR结果

与对照组比较，染砷小鼠大脑皮质Eif2s3y的mRNA表达量随染砷浓度的增高而增加，尤其4 mg/L染砷组Eif2s3y表达最为明显。β-Actin作为内参(图1)。

2.3 染砷小鼠大脑髓质 Eif2s3y的 RT-PCR结果

染砷小鼠大脑髓质Eif2s3y的mRNA表达量均比对照组增加，尤其4 mg/L染砷组Eif2s3y表达最为明显。β-Actin作为内参(图2)。

2.4 染砷小鼠小脑Eif2s3y的 RT-PCR结果

染砷小鼠小脑Eif2s3y的 mRNA表达量与对照组比较，无明显变化。β-Actin作为内参(图3)。

图1 小鼠大脑皮质Eif2s3y的mRNA表达

图2 小鼠大脑髓质Eif2s3y的mRNA表达

图3 小鼠小脑Eif2s3y的mRNA表达

3 讨 论

砷可通过血液和脑脊液进入脑实质而损伤脑组织[7]，导致脑功能失调而引起一系列的临床表现。脑不仅调节机体的记忆和行为功能还参与调节机体的生殖功能。丘脑-垂体-睾丸轴调节着男性激素水平和生殖功能[8]。通过下丘脑-垂体-性腺轴的反馈及负反馈作用来调节内分泌激素，使外周激素的水平保持相对稳定，而外周激素的水平保持相对稳定对维持男性生殖功能的正常是一个重要因素。最近研究表明性基因在脑中表达也参与调节机体的外周性激素的水平。Y染色体基因表达雄性遗传信息，参与调节雄性动物内分泌和行为等功能。Eif2s3y是在雄性动物脑中表达的主要Y染色体基因， 其编码的蛋白参与调节雄性生殖功能[9]。本研究的基因芯片结果显示，砷暴露雄性小鼠大脑皮质Eif2s3y基因的表达增多。且RT-PCR结果也显示，砷暴露雄性小鼠大脑皮质和髓质Eif2s3y的mRNA表达显著高于对照组。本研究结果表明，亚慢性砷暴露可能显著上调Eif2s3y基因在雄性小鼠大脑组织的表达。而砷暴露小鼠小脑组织，其Eif2s3y的mRNA表达在基因芯片结果显示明显高于对照组。但RT-PCR结果显示，与对照组比较砷暴露雄性小鼠小脑组织Eif2s3y的mRNA表达没有显著增多。对于这两种基因表达检测方法测定结果的不一致，可能需要用更精确的实时定量PCR加以确认。

Eif2s3y很可能是砷雄性生殖毒性作用的一个靶基因。今后有必要进一步从蛋白质水平验证亚慢性染砷对大脑组织Eif2s3y表达的影响，同时通过一系列干预实验探讨砷对小鼠脑组织Eif2s3y基因表达的影响与小鼠雄性生殖功能异常之间的因果关系是非常必要的。

[1] Hsieh FI, Hwang TS, Hsieh YC, et al. Risk of erectile dysfunction induced by arsenic exposure through well water consumption in Taiwan[J]. Environ Health Perspect, 2008, 116: 532-536.

[2] Chiou TJ, Chu ST, Tzeng WF, et al. Arsenic trioxide impairs spermatogenesis via reducing gene expression levels in testosterone synthesis pathway[J]. Chem Res Toxicol, 2008, 21: 1562-1569.

[3] Li Y, Wang M, Piao F, et al. Subchronic exposure to arsenic inhibits spermatogenesis and down-regulates the expression of Ddx3y in testis and epididymis of mice[J]. Toxicol Sci, 2012, 128(2): 482-489.

[4] 齐岩，朴丰源. 亚慢性砷暴露对雄性小鼠脑组织性基因Jarid1d表达的影响[J].大连医科大学学报, 2011, 33(2): 107-110.

[5] Xu J, Distechea CM. Sex differences in brain expression of X- and Y-linked genes[J]. Brain Res, 2006, 1126: 50 - 55.

[6] Touré A, Szot M, Mahadevaiah SK, et al. A new deletion of the mouse Y chromosome long arm associated with the loss of Ssty expression, abnormal sperm development and sterility[J]. Genetics, 2004, 166: 901-912.

[7] Biswas U，Sarkar S，Bhowmik MK，et al．Chronic toxicity of arsenic in goats：Clinical biochemical changes，pathomorphology and tissue residues[J]．Small Rumin Res, 2000，38：229-235．

[8] Jana K, Jana S, Samanta PK. Effects of chronic exposure to sodium arsenite on hypothalamo-pituitary-testicular activities in adult rats: possible an estrogenic mode of action[J]. Reprod Biol Endocrinol, 2006, 4: 1-13.

[9] Akimoto C, Kitagawa H, Matsumoto T, et al. Spermatogenesis-specific association of SMCY and MSH5[J]. Genes Cells, 2008, 13: 623-633.