ω-芋螺毒素研究进展

左艳敏王筱婧王东兴钱秋玉程远国

(1.北京军区总医院263临床部药剂科，101149；2.军事医学科学院微生物与流行病研究所药物研究室，100071)

芋螺毒素(Conotoxins)是自海洋腹足纲软体动物芋螺(Conus)中得到的一类具有生物活性的肽类毒素[1]。我国约有近百余种芋螺分布，集中在南海、北部湾和台湾海域，其中每种芋螺的毒液中均含有百余种不同的活性多肽即芋螺毒素，且不同种的芋螺所含的芋螺毒素也各不相同，因此至少存在5万多种芋螺毒素。芋螺毒素可引起动物出现惊厥、颤抖甚至麻痹死亡。迄今为止，已经分离鉴定了百余种芋螺毒素[2-5]。

芋螺毒素一般是含有7～46个氨基酸残基的小肽，分子量小，富含二硫键，前导肽高度保守而成熟肽具有多样性，是迄今发现的最小的核酸编码的动物神经毒素肽。芋螺毒素能选择性地作用于离子通道等蛋白受体，进而影响神经传导，产生不同的生理作用[6]。根据芋螺毒素基因及其前体蛋白信号肽的保守性，可将其分为A、O、T、M、P、I等多个超家族，在每个超家族中，再依据其对生物体作用靶位以及药理活性的不同又可将其分为α、ω、μ、δ等不同的亚型。α、αA、κA属于A-超家族，ω、δ、κ、μO属于O-超家族，μ、φ、κM属于M-超家族。

O-超家族芋螺毒素主要作用于电压门控离子通道(又称电压敏感性通道)，包括Ca2+通道、Na+通道和K+通道等。作用于Ca2+通道的只有O-超家族的ω-芋螺毒素。由于ω-芋螺毒素具有高亲和力、高度专一性的特点，能特异性地阻断电压敏感型Ca2+通道，在离子通道亚型鉴定、神经疾病治疗方面发挥重要作用，已成为神经生物学、分子生物学、多肽化学、药理学等领域的研究热点[6-12]。下面就其药代动力学研究进展以及合成方法两方面进行阐述。

1 ω-芋螺毒素的药代动力学研究

目前对ω-芋螺毒素的药代动力学研究主要集中于其已上市的合成等效物Ziconotide。Ziconotide是首个应用于临床的具有神经元特异性的N-型电压敏感性钙通道阻断剂，已分别获得美国FDA和欧盟EC的上市许可。其作用机制是通过鞘内输注治疗严重慢性疼痛，可缓解其他治疗无效的疼痛，并且长时间应用该药不会产生成瘾性及耐受性。

1.1 临床前药动学研究 Bowersox等人[13]对Ziconotide 24 h持续、匀速静脉输注时在大鼠及猕猴体内的代谢情况进行了研究。采用放免法对不同时间的血浆药物浓度进行了测定。结果显示两种动物的药动学参数很相近，且各项参数无剂量及性别依赖性；开始滴注后的2～4 h内，到达稳态血药浓度(Css)，且所得数据符合二室模型；稳态时的分布体积(Vd)约为体质量的40%，表明药物在血管内外均有分布，血管外药物分布于细胞外和细胞内的体液中；大鼠和猕猴的血浆蛋白结合率分别为56%和73%，且呈非特异性、非饱和性和低亲和力，因此药物不会在血管内滞留。其清除过程由两阶段组成，消除曲线为双指数曲线。大鼠和猕猴的表观清除半衰期分别为4.61 h和6.48 h。大鼠在滴注开始1 h内，高低剂量组分别约有93%和17%出现轻微震颤；猕猴在滴注开始0.5 h内，所有高剂量组和50%低剂量组出现轻微震颤。

在Elan公司关于犬的药动学研究报告[14]中，单次鞘内注射Ziconotide后，其在犬的脑脊液中快速分布，进而迅速分布至脊髓及其他组织。持续鞘内滴注Ziconotide后，在脑脊液中的药物浓度与在血浆中的药物浓度之比约为1 000∶1，表明其主要分布于作用靶点。在实验中结合H3-inulin，结果显示Ziconotide在脑脊液中的清除速度与脑脊液本身的总体流动速度接近。

Staats等人[15]的研究表明，鞘内注射的Ziconotide在血浆中消除迅速，因此导致相当少的血浆蛋白结合。静脉注射的Ziconotide于2～24 h即在大鼠的脑组织中降解，并且检测不到所产生的中间代谢产物，其从脑脊液和循环系统中清除的速度也较快，表明Ziconotide在脑脊液中的分布和代谢也是迅速的。

Newcomb等人[16]研究了Ziconotide的脑内生物利用度、血-脑通透性及其在脑细胞外液的扩散、降解情况。静脉注射Ziconotide后，约3～20 min，在大鼠脑内的浓度达到最大值，每克组织中的药物浓度约为0.003%～0.006%，2 h后降至每克组织中含0.001%。在海马植入体内使用透析探针灌注Ziconotide时，也有相似的结果。图像分析和连续切片法均显示在透析探针周围细胞外液中Ziconotide的含量很少，2 h后其范围也在1 mm以内。

1.2 临床药动学研究 健康男性志愿者静脉持续滴注本品的血浆药物浓度-时间数据表明，该药物符合线性消除的二房室开放性药动学模型。血浆稳态浓度与滴注速率成比例。消除半衰期为1.3 h，t1/2约为5.3 h[17]。

Wermeling[14]和Staats等人[15]还研究了Ziconotide在脑脊液中的药动学(PK)，以及其在血浆和脑脊液中的浓度与安全性和有效性的关系(PK-PD关系)。鞘内注射Ziconotide(1、5、7.5或10 μg·kg-1·d-1)于22名慢性非恶性疼痛患者后48 h内，脑脊液中的药物浓度曲线可能呈多房室特征；脑脊液中药物半衰期为2.9～6.5 h(平均为4.5 h)，清除率为0.26 mL·min-1，分布容积为99.2 mL。剂量标准化AUC、Cmax，Cl，Vd和t1/2等均与剂量成比例，提示其在脑脊液的分布不随剂量增加而出现饱和现象。脑脊液的平均值和中间值分别是155 mL和99 mL，均与成人的脑脊液体积约(130±30)mL接近。脑脊液的AUC/D平均值是70.8 ng·h·mL-1·μg-1，t1/2是4.6 h，Cmax/D是15.0 ng·mL-1·μg-1。脑脊液与血浆中的药物浓度比是303∶1 165。PK-PD有相关性。采用疼痛强度视觉模拟评分及疼痛缓解分类评分观察到镇痛效果与剂量相关，但大剂量在增强镇痛效果的同时也增加了神经系统副作用发生的可能。4例病人给药后出现低血压。

Ziconotide在血浆和脑脊液中呈线性清除过程[17]，与其以1～10μg·kg-1·d-1静脉滴注时血浆中的特征一致[18]。脑脊液Cl的平均值和中间值分别是0.38 mL·min-1和0.26 mL·min-1。成人脑脊液形成或消除的速度是0.35～0.37mL·min-1，即其在脑脊液中的清除速度与脑脊液本身的总体流动或称周转率接近[15]，这与动物实验中的结果相吻合。

2 ω-芋螺毒素的合成

目前解决药源问题主要有三种方法。

第一种是自天然芋螺毒管中直接提取，此方法获取量非常少，且近年来海洋生态的破坏使得野生芋螺数量急剧减少，该法会进一步加剧芋螺资源恶化，因此靠分离提取获得大量的ω-芋螺毒素用于研究和生产并不现实，但提取到的少量天然毒液可通过一系列仪器分析手段得到单个毒素肽的氨基酸序列，再根据所得序列人工合成这些肽，可进一步用于活性测试和结构分析。

第二种是基因工程方法，即将芋螺毒素的基因转化到微生物中使其表达，后期再进行分离纯化[19]。由于部分ω-芋螺毒素的N端为Cys，酰胺化C端，加之原核表达系统无法加工去除N-端信号肽序列，无法解决酰胺化C端问题，且ω-芋螺毒素分子小，碱性氨基酸较多，难于形成特定活性构象，使得分离纯化较为困难。但随着基因工程技术的日新月异，用芋螺毒素成熟肽基因，加接原核或真核生物的信号肽，或同时转入酰胺化酶基因，可望在不久的将来生产出大量廉价的重组芋螺毒素，这对芋螺毒素药物研究和产业化将起到至关重要的作用。另一方面，芋螺毒素是基因直接表达的产物，现代基因工程技术也促进了芋螺毒素的研究与开发。目前国内外对芋螺毒素的研究已深入到了分子生物学领域，在研究芋螺毒素基因的结构和生物合成过程，寻找新芋螺毒素基因，研究其分子遗传学机制，蛋白质折叠机制方面有重要的应用，且已取得了较快的进展。构建芋螺毒素cDNA文库，从中筛选新ω-芋螺毒素基因已成为研究新ω-芋螺毒素及其分子特征的重要途径之一[20]。

第三种是采用人工化学合成的方法，即通过分离天然芋螺毒素后测序或采用基因克隆方式获得芋螺毒素序列，然后采用人工化学合成获得更多量的芋螺毒素，目前较多使用的是多肽固相合成法。与传统的多肽液相合成法相比，该法具有如下优越性：只需经过过滤和冲洗，就可以将产物多肽从可溶性试剂中分离开来；易于使用自动化设备；过量的反应试剂促使反应彻底进行；反应产物多肽一直结合在固相载体上，损失量将达到最小。根据氨基端保护基的不同，固相合成芋螺毒素常用方法为Fmoc法和Boc法。Fmoc法具有反应条件温和、副反应少等特点，大多芋螺毒素的合成都采用该方法[21-24]。合成后将肽链从树脂上裂解下来，常用的裂解剂为reagent K试剂(trifluoroacetic acid∶water∶ ethanedithiol∶ phenol∶thioanisole，90∶5∶ 2.5∶7.5∶5)。接着脱去侧链保护基、复性、纯化，即可得到与天然毒素活性相同的肽，也可以合成其同系物进行结构和功能的研究[25-26]。但由于ω-芋螺毒素氨基酸残基较多，一般都在25个以上，其人工合成的产率较小，纯度也低，合成的肽还需氧化折叠才能形成正确的构象。氧化折叠的方法有空 气 氧 化 法 、DMSO、DTT/cysteine、gluthatione氧 化 法 等 。Favreau等[27]在合成ω-CNVIIA时，对这几种氧化折叠方法作了比较，发现gluthatione氧化法效果最好。随后进行纯化，即可得到具有天然毒素活性且纯度较高的多肽，最后利用NMR技术进行构象分析[28-29]。因此，人工合成ω-芋螺毒素的成本较高，还不能完全满足作为药物商业化生产的要求。但由于ω-芋螺毒素药物的用量小，效果好，价值高，人工合成可部分满足市场需求。

综上所述，ω-芋螺毒素具有分子小，结构稳定，易化学合成等特点，是一个阐明蛋白质结构与功能的微型模型。海洋中有丰富的芋螺资源，为人类提供了良好的资源信息库。目前得到的ω-芋螺毒素大多来源于食鱼芋螺，但食虫芋螺和食螺芋螺当中也存在丰富的ω-芋螺毒素。国外已对30多种芋螺进行了研究，由于芋螺所处的地理环境不同，同一芋螺所产生的芋螺毒素可能会完全不同。国内主要对几种芋螺(浅纹芋螺、织锦芋螺和桶形芋螺)毒素基因和毒液成分进行了研究，绝大多数海南产的芋螺毒素急待研究与开发。虽然ω-芋螺毒素研究已经在生化、分子生物学、电生理和药理等方面取得了重要进展，但其深度和广度还十分不够，有待于进一步研究，为芋螺资源的开发利用提供更多理论依据。

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