星点设计-效应面法优选丹参中丹参总酚酸的提取工艺

卢君蓉，傅超美，刘芳，章津铭，林俊芝，胡慧玲

(成都中医药大学药学院中药材标准化教育部重点实验室、中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川成都611137)

丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根茎，味苦、性微寒。归心、肝经，为常用川产道地药材之一，具有活血化瘀、凉血消痈的功效［1］。所含丹参总酚酸为其主要的水溶性有效成分，主要含有丹酚酸B、迷迭香酸等;丹参总酚酸提取物被收载于《中国药典》2010年版一部植物油脂和提取物项下［2］。星点设计(CCD)为国内外近年来常用于优化药材和制剂提取工艺、处方筛选的方法，该方法简便、直观，且在模型建立上采用非线性数学模型拟合，复合相关系数较高，预测值更接近真实值［3-9］。本试验中引入星点实验设计结合效应面法优选丹参中丹参总酚酸的提取工艺。

1 仪器与试药

LC—10AT高效液相色谱仪(日本岛津株式会社);UV—1100紫外—分光光度计(上海天美科学仪器公司);BP211D电子分析天平(十万分之一，德国Sartorius公司);BP121S电子分析天平(万分之一，德国Sartorius公司);202-2型干燥箱(上海市实验仪器总厂)。

丹参药材购于成都荷花池中药材专业市场，经成都中医药大学中药标本馆卢先明教授鉴定为丹参Salvia miltiorrhizaBge.的根及根茎。丹酚酸B对照品(成都曼斯特生物制品公司，批号A0056，纯度≥98%)，乙腈(色谱纯)，甲醇(色谱纯)，水为蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

试验中参照《中国药典》2010年版一部丹参药材项下定量测定方法［2］和文献方法［10］对各样品中丹酚酸B和丹参总酚酸的含有量进行测定。

2.1 丹酚酸B测定［2］

2.1.1 色谱条件Diamonsil钻石ODS-C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm);柱温25℃;流动相为甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)，体积流量1 mL/min;检测波长286 nm;进样量10 μL。

2.1.2 对照品溶液的制备取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加75%甲醇定容至10 mL棕色量瓶中，用孔径为0.45 μm的微孔滤膜滤过，得质量浓度为0.146 mg/mL的丹酚酸B对照品溶液，备用。

2.1.3 样品溶液的制备取丹参粉末(过三号筛)约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用75%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 标准曲线的绘制取2.1.2项下丹酚酸B对照品溶液10、12、14、16、18 μL，分别注入高效液相色谱仪，以峰面积(Y)为纵坐标，丹酚酸B的进样量为横坐标(X)，绘制标准曲线，得回归方程为Y=1×106X－225 177(r=0.999 9)，进样量在1.47～2.94 μg范围内，线性范围良好。2.1.5药材定量测定取已制备好的丹参样品溶液，共3份，每份进样10 μL，计算丹参样品中丹酚酸B的含有量，得到丹参样品中丹酚酸B的平均质量分数为6.62%，高于2010年版《中国药典》一部丹参项下含丹酚酸B(C36H30O16)不得少于3.0%的规定，为合格药材。

2.2 丹参总酚酸定量测定［10］

2.2.1 对照品溶液的制备取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加蒸馏水定容至10 mL棕色量瓶中，用孔径为0.45 μm的微孔滤膜滤过，得质量浓度为0.146 mg/mL的丹酚酸B对照品溶液，分别从其中精密移取0、0.3、0.6、1.3、2.5、5 mL加水定容至10 mL，精密移取稀释液2 mL，分别依次加入0.5%的NaNO25 mL、10%的Al(NO3)30.5 mL、1 mol/L的NaOH 5 mL，静置显色后，备用。

2.2.2 样品溶液的制备取各试验安排下的提取液续滤液1 mL，加水定容至25 mL，再精密吸取1 mL溶液，定容至10 mL，精密移取稀释液2 mL，按2.2.1项下显色方法显色，即得。

2.2.3 标准曲线的绘制以空白显色溶液为对照，取2.2.1项下丹酚酸B对照品溶液，分别在499 nm条件下测定其吸光度，以其吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标作图，得到标准曲线方程为:Y=4.467 7×X－0.002 3(r=0.999)，质量浓度在0.001～0.01 mg/mL范围内，线性范围良好。

2.3 星点设计试验丹参酚酸类为水溶性成分，且受热易分解，预试验对超声法、回流法、温浸法3种方法进行比较，以温浸法较好，故以溶媒用量、提取温度、提取时间为考察因素，提取次数为非连续变量，回归处理较困难，结合预试验结果和工业生产的实际，设定提取次数为2次，其余因素的水平据试验结果而定。影响因素及水平见表1，分别取50 g丹参药材粉末，以丹酚酸B含有量、丹参总酚酸含有量、干膏量三者的加权评分值为指标，按表2中试验安排进行试验。

表1 影响因素及水平

2.4 模型拟合用Design Expert 7.0统计软件，以丹酚酸B含有量、丹参总酚酸含有量、干膏量三者的总体归一值为指标对各因素进行多元线性回归和二项式方程拟合。

所得多元线性回归方程:Y=0.64+0.14X1－0.075X2－0.039X3(F=16.93，r=0.872 1，P＜0.001);

拟合所得二项式方程:Y=－3.594 97+0.286 16×A+0.062 018×B+0.012 321×C－2.580 44×10－3×A×B－3.684 45×10－4×A×C－2.629 61×10－4×B×C+1.484 3×10－3×A2－1.322 6×10－4×B2+4.378 72×C2×10－5(F=8.07，r=0.937 5，P＜0.001 5)。采用相关系数对两种拟合方式进行比较可知，采用二项式方程拟合较好，可信度较大，对结果的模拟优化效果较好。

2.5 工艺优化与估测因变量曲面图是三维图，只能表达两个自变量的函数，因此固定三个自变量之一为中值，以拟合的目标函数为数学模型，应用Design Expert 7.0统计软件绘制因变量三维图及等高图。见图1～3。

由溶媒用量与温浸温度两因素作图可知，在溶媒用量为10.5～12.0倍、温浸温度为60～75℃范围内，提取的总体归一值最高;由溶媒用量与温浸时间两因素作图可知，当溶媒用量在10.5～12.0倍、温浸时间在105～150 min范围内，提取的总体归一值最高;由温浸温度与温浸时间作图可知，当温浸温度在65～67.5℃、温浸时间在127.5～150 min范围，提取的总体归一值值最高。综合以上信息，可得选取的最佳范围为溶媒用量为10.5～12.0倍、温浸温度为65～67.5℃、温浸时间为127.5～150 min。

考虑到工业生产中关心投入产出比和成本问题，以及预试验的结果，故将本试验优选的丹参总酚酸提取的最佳工艺为丹参药材粉末(过一号筛)，加入11倍量水，在65℃下提取2次，每次130 min。

表2 星点设计及结果

图1 溶媒用量与温浸温度对OD影响的三维图和等高图

图2 溶媒用量与温浸时间对OD影响的三维图和等高图

2.6 验证试验对以上所得工艺进行验证，见表3。

图3 温浸温度与温浸时间对OD影响的三维图和等高图

表3 验证试验(n=3)

3 讨论

3.1 丹参为常用川产道地中药材之一，在本试验中以丹酚酸B含有量、丹参总酚酸含有量及干膏量三者的总体归一值为评价指标优化丹参总酚酸的提取工艺，结果表明，建立的丹参总酚酸评价方法简便、稳定、可行。同时，对本试验所建立的最佳工艺与《中国药典》工艺进行了比较:参照《中国药典》2010年版一部所收载的丹参总酚酸提取物项下制备样品，对其进行了丹酚酸B的测定，结果表明本试验所建立的最佳工艺丹酚酸B转移率高于《中国药典》方法。采用星点设计结合效应面优化法优选中药材等的提取工艺，考察因素的水平范围更大，同时采用非线性数学模型拟合，复相关系数较高，可信度较好，预测值更接近真实值，本试验的结果可以为进一步完善丹参总酚酸提取物制备方法的国家标准提供一定的参考。

3.2 星点设计结合效应面优化法所得结果更加直观、便于分析。进一步分析本试验拟合所得二项式方程及变量三维图，试验所设计的各因素中溶媒用量、温浸时间与试验结果成正相关，且溶媒用量影响较大;而温浸温度在一定范围内成正相关，超过一定值后成负相关，且对试验结果的影响大于温浸时间。此结果与单因素预试验所得结果趋势相吻合，且所得的结果参数更加明确。本法更适合于探索性的试验研究，且试验结果精确度较高，在试验设计中更具优势。

3.3 本试验中所建立的星点设计-效应面法优化丹参总酚酸的提取工艺，为丹参及其他中药材的提取、加工和开发提供了参考和依据，也为进一步开发川产道地药材奠定了基础。

［1］张廷模.临床中药学［M］.上海:上海科学技术出版社，2006:244.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010.

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