叶下珠总黄酮的半仿生提取工艺

蓝峻峰，谢济运

(柳州师范高等专科学校化学与生命科学系，广西柳州545004)

草药叶下珠(Phyllanthus urinaria L.)为大戟科植物的全草，又称珍珠草、落地油柑、叶后珠、关门草等，具有平肝清热、利水解毒之效，常用于治疗肠炎、肝炎等炎症及痢疾、尿路感染、无名肿痛等［1-2］。现代医学研究表明，叶下珠具有抗乙肝病毒和保肝、护肝作用［3］。黄酮类化合物分子由具两个酚羟基的苯环通过居于中央位置的三碳原子相互连接而成，其分子结构中常连接有甲基、甲氧基及酚羟基、异戊烯基等还原基团，因此黄酮类化合物具有效清除人体内的氧自由基功效，是一种常见的强抗氧剂。黄酮类化合物的生理活性作用较为广泛，除具有对心脑缺血损伤、肝损伤、心律失常的保护作用外，还具有镇痛、抗自由基和抗肿瘤等作用［4］。鉴定研究表明，叶下珠植物中含有黄酮类化合物［5］，经体外灭活HBV抗原作用实验证明总黄酮为其抗病毒有效成分之一［6］。

半仿生提取法是将整体药物研究法与分子药物研究法相结合，为经人类消化道给药的中药及其复方药剂创立的一种提取新技术［7］，该法模仿口服药物在人体胃肠道中的转运过程，采用选定pH值的酸性和碱性水依次提取得到活性混合物。目前，叶下珠成分提取工艺主要以传统有机溶剂提取为主［8］，这些方法提取有机溶剂残留量大，副作用高，且提取效率低，成本高。本研究运用半仿生法原理，用特定pH的水溶液为溶剂，提取叶下珠黄酮，并用正交实验优化其提取工艺。

1 材料、试剂及仪器

1.1 材料及试剂叶下珠草药，购于广西柳州市中药材市场，经覃逸明博士鉴定为大戟科叶下珠(Phyllanthus urinaria L.)全草。芦丁对照品(2010-A0103，纯度＞98%)，购于中国成都曼思特生物科技有限公司;实验用水为蒸馏水，由实验室自制;氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠及盐酸等均为分析纯试剂。

1.2 仪器及设备UV-2102PCS型紫外-可见分光光度计，购于上海尤尼科仪器有限公司;RE-52A型旋转蒸发仪，购于巩义市予华仪器厂;pHS-3C型精密酸度计，购自上海雷磁仪器厂;SHZ-D(III)型循环水式真空泵，由河南巩义市英山谷予华仪器厂提供;YJ501型超级恒温器，由上海跃进医疗器械厂提供;电子天平，由梅特勒-托利多仪器厂提供;远红外快速恒温干燥箱，购自上海跃进医疗器械厂。

2 方法

2.1 对照品溶液的制备称取芦丁对照品32 mg，用70%乙醇溶液溶解后，转移至50 mL量瓶中，继续用乙醇溶液稀释、定容，得质量浓度为0.64 mg/mL芦丁对照品贮备液。

2.2 标准曲线的绘制及回归方程的建立实验选用芦丁为对照品，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH体系吸光法［9-11］制作黄酮测定标准曲线。移取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的上述2.1项芦丁对照品贮备液分别置于6只量瓶中，加入NaNO2溶液还原6 min，随后加入Al(NO3)3溶液络合，再加入NaOH溶液5 mL，用乙醇溶液稀释、定容，摇匀、显色10 min后，于波长为510 nm处，以试剂空白作为参比，用紫外-可见分光光度计分别测定上述溶液的吸光度值。以芦丁质量浓度为纵坐标(C)，以吸光度值为横坐标(A)，制作标准曲线，得回归方程为:C=93.889A－0.360 3，相关系数r=0.999 8，曲线中黄酮质量浓度线性范围为0～64 μg/mL。

2.3 半仿生提取

2.3.1 提取溶剂的制备根据仿生学原理，人体消化道(胃、小肠、大肠)体液酸度pH分别为2.0、7.5、8.3［12］，因此，实验中用HCl和Ca(OH)2饱和溶液将提取溶剂pH分别调为2.0、7.5、8.3，备用。

2.3.2 样品的处理及制备取叶下珠全草经粉碎、过筛(60目)后，称取20.00 g于圆底烧瓶中，在一定条件先用pH 2.0的提取剂提取，冷却后过滤，收集滤液，所得滤渣分别再用pH 7.5、8.3的提取溶剂各重复提取一次，冷却、过滤，合并提取所得滤液，经减压浓缩得叶下珠提取液。提取液中总黄酮按2.4项的方法测定。

2.4 黄酮的测定吸取一定量叶下珠提取液于25 mL量瓶中，按上述2.2项黄酮对照品质量浓度的测定方法依次加入相应的溶液后测定其吸光度，并计算总黄酮提取得率。

2.5 正交实验设计在查阅文献的基础上，选取提取温度、提取时间、料液比等三因素，每个因素3个水平进行实验，选用L9(34)正交表进行实验设计优选半仿生法提取工艺条件。实验因素、水平安排如表1。每个实验分别在pH 2.0、7.5、8.3的溶剂中提取一次，合并滤液后测定黄酮。

表1 正交实验因素水平表

2.6 验证实验依据正交实验结果，按2.3.2项样品处理及制备的方法，在最优工艺条件下提取叶下珠总黄酮，平行实验3次。

3 结果及分析

3.1 正交实验结果及直观分析根据实验安排，提取叶下珠总黄酮的正交实验结果见表2。

表2 正交实验结果及分析表

从表2中极差R的大小可看出，在实验考察的三个因素中，对黄酮提取得率影响的主次关系为:A(提取温度)＞C(料液比)＞B(提取时间);通过比较各因素的不同水平的k值，可得半仿生法提取叶下珠黄酮最佳工艺为A3B1C2，即提取温度85℃，提取时间1.5 h，料液比1∶20。

3.2 正交实验结果的方差分析实验的方差分析结果见表3。

表3 实验结果方差分析表

从表3中可以看出，考察的实验因素中，在考察的因素水平范围内，温度对叶下珠黄酮的提取得率的影响显著，料液比对叶下珠黄酮的提取得率有一定的影响，时间对叶下珠黄酮的提取得率的影响不显著。

3.3 验证实验结果利用正交实验的最佳工艺条件，即提取温度85℃，提取时间1.5 h，料液比1∶20做验证实验，平行3次，结果见表4。

表4 验证实验结果表

3次验证实验平均提取得率为1.505%，RSD=0.433%，结果为所有实验中最高的。该实验结果表明，半仿生提取法用于叶下珠总黄酮的提取，黄酮得率高，方法可靠，结果准确。

4 结论

4.1 运用半仿生法提取叶下珠总黄酮时，用pH分别为2.0、7.5、8.3的水溶液为提取溶剂各提取一次，用正交实验考察提取温度、提取时间和提取料液比对提取得率的影响，结果表明:在考察的因素水平范围内，温度对叶下珠黄酮提取得率影响显著，时间对叶下珠黄酮提取得率影响不显著，料液比对黄酮得率有一定的影响。各因素对黄酮提取得率的影响大小次序为:提取温度＞料液比＞提取时间。叶下珠总黄酮的最佳提取工艺条件为:提取温度85℃，料液比1∶20，提取时间1.5 h。用此工艺提取叶下珠黄酮提取得率较高，可达1.505%，优于文献显示的传统方法提取效果［13］。

4.2 与传统的提取方法比较，半仿生提取法模拟人体口服给药过程，以不同pH的水溶液为提取溶剂，不使用有机溶剂，减少对环境及生产操作人员的身体伤害，对环境友好，易于实现绿色化生产，且提取得率较高，利于降低生产成本。

［1］江苏新医学院编.中药大辞典:下册［M］.上海:上海科学技术出版社，1997:1496.

［2］全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编:上册［M］.北京:人民卫生出版社，1978:263.

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