桑叶药材水浸出物和指标成份的含量测定研究

李克雄 高崇凯

桑叶药材水浸出物和指标成份的含量测定研究

李克雄 高崇凯

目的 研究桑叶药材的质量，通过药材提取物（流膏、干膏和浸出物）和指标成份含量的测定以及药材的薄层鉴别，从定量角度来研究药材质量。方法 主要采用高效液相色谱法，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-乙腈-醋酸-水（15:10:2.6:72.4）为流动相，检测波长为358nm，流速1mL/min，柱温30℃。结果 不同产地5批桑叶原药材、流浸膏和干膏各样品之间的芦丁含量具有明显的差异，即便是同一产地不同批号的样品芦丁含量也存在很大的差别。其原药材、流浸膏和干膏芦丁含量的大小次序是一致的，广西090901的含量最高分别是0.30%、0.124%和0.048%，湖北2最低分别是0.11%、0.095%和0.035%。浸出物的含量测定亦有差异，但均符合标准。水分测定几乎无差异符合规定。结论 通过对桑叶药材浸出物和指标成份的含量测定，可从定量的角度更好地对药材质量进行控制。

桑叶；浸出物；高效液相色谱法；含量测定

桑叶为桑科植物桑Morusalba L的干燥叶。中国是桑树的故乡，其资源极为丰富，品种繁多，分布于中国大部分地区，以江苏、浙江和四川等地产量较大［1］。桑叶性寒、味甘苦，具有疏散风热，清肺润燥、清肝明目、凉血止血之功效，是常用中药之一。本草纲目记载，桑叶乃手足阳明之药,汁煎代茗，能止消渴，名目长发。现代药理证明桑叶具有降血糖、降血压及抗衰老、抗肿瘤、抗心脑血管疾病和抗菌与抗病毒等多种药理作用。桑叶中含有黄酮及其苷、生物碱、多糖、挥发油、各种氨基酸、微量元素等多种成份[2]，黄酮类成份是其主要之一[3]。芦丁是桑叶所含黄酮类成份主要一种。因产地、采集时间不同以及炮制方法等原因会导致其药材质量有很大的差异。本实验主要采用HPLC法通过对桑叶提取物、芦丁含量测定和薄层色谱鉴别等分析研究药材质量，为更好地开发利用桑叶资源并评价药材内在质量提供依据。芦丁的化学结构式如图1。

1 仪器与材料

LC-10ATvp高效液相色谱仪（岛津，日本），SPD-10Avp可见紫外检测器，HH-6恒温水浴锅（江苏金坛市宏华仪器厂），DL-360A超声波清洗器（上海之信仪器有限公司），FA/JA系列电子天平（上海精天电子仪器有限公司），JY 20002电子天平，GZX-9240MBE数显鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。

桑叶批号分别为广西090901、广西090903、广西091002，湖北2，山东等均为市售。对照品芦丁（中国药品生物制品检定所，批号0080-9705）；桑叶（中国药品生物制品检定所，批号121123-200904）。甲醇、乙腈（色谱纯，天津康科德科技有限公司），醋酸（分析纯，天津大茂化学试剂厂），蒸馏水(屈臣氏香港有限公司)。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 供试品溶液的制备 取本品粉末2g，置圆底烧瓶中，加甲醇50mL，加热回流3min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解即为供试品溶液。

2.1.2 对照品溶液的制备 取桑叶对照药材2g，加甲醇同以上方法制成对照药材溶液。

2.1.3 色谱鉴别 吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5:2:1)的上层溶液为展开剂，置用展开剂预饱和10min的展开缸内，展开约至8cm，取出、晾干，置紫外光灯(365nm)下检视[4]。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。色谱图如图2。

2.2 浸出物芦丁含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取对照品10.00mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为100.0mg/L的溶液，作为芦丁对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称定桑叶1g,置25mL容量瓶中，甲醇超声提取30min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀即得。

图1 芦丁化学结构式。

2.2.3 色谱条件与系统适用性试验 采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-乙腈-醋酸-水（15:10:2.6:72.4）为流动相，检测波长为358nm，流速1mL/min，进样量10μL，柱温30oC，理论塔板数按芦丁计算应不低于3000。芦丁与相邻成份色谱峰的分离度应不小于1.5，拖尾因子均在0.95～1.05。色谱图如图3。

2.2.4 线性关系考察 精密量取芦丁对照品容液0.1、0.2、0.5、0.8、1.2mL分别置于10mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,制成质量浓度为10.0、20.0、50.0、80.0、120.0mg/L的系列标准溶液，分别精密吸取上述溶液各10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积(A)为纵坐标，溶液质量浓度(ρ/mg·L-1)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为A=1.828×107ρ-9.11×102(r=0.999 9)。结果表明芦丁在质量浓度10.0、20.0、50.0、80.0、120.0mg/L内线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液10μL进样，按“2.2.3”条色谱条件重复进样6次，测量芦丁峰面积，计算RSD=1.08%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 将供试溶液室温放置，按“2.2.3”条色谱条件,分别在制备供试溶液后的0、1、2、4、6、8h进样，测定峰面积RSD=1.46%，表明供试溶液在8h内稳定。

2.2.7 重复性试验 取同一批的桑叶药材样品5份,每份约1g，按“2.2.2”条制成供试溶液，在“2.2.3”条色谱条件下测定。测定结果RSD为1.19%，含量测定方法重复性良好。

2.2.8 回收率试验 取已知含量的桑叶(广西产地，批号:090901)粉末供试品9份各2g精密称定，分成3组，每组3份，分别精密加入质量浓度为100mg/L的芦丁对照品溶液1.0、1.5、2.0mL,测定含量,计算平均回收率为98.9%,RSD为0.98%(见表1)。

2.2.9 供试品含量测定 分别取5批不同产地的桑叶药材、桑叶流浸膏和干膏按照“2.2.2”条制成供试溶液，在“2.2.3”条色谱条件下测定，记录色谱图,按外标法计算样品中芦丁的含量(见表2)。

2.2.10 浸出物和水分的测定 分别按照醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定，用无水乙醇作溶剂，不得少于5.0%和按照水分测定法测定，不得多于15.0%[4](见表3)。

图2 薄层色谱图。

图3 高效液相色谱图。

表1 加样回收率试验结果（n=3）

3 讨论

3.1 检测波长的选择 配制一定浓度的对照品溶液，以甲醇液为空白,用紫外-可见分光光度计扫描紫外图谱，结果在358nm处有最大吸收，故确定检测波长为358nm。

3.2 样品提取条件的选择 笔者比较了浸提法、回流法和超声提取桑叶中芦丁，但浸提法芦丁峰分离不好，回流法工艺复杂，耗时较长，而超声法简便、快速、有效、灵敏，可作为供试品的提取方法。

表3 浸出物与水分测定结果

3.3 流动相的选择 试验考察了几种流动相系统，结果表明用甲醇-乙腈-醋酸-水（15:10:2.6:72.4）流动相系统洗脱得到的桑叶色谱峰峰形好,柱效高,可达到理想的分离度。

3.4 薄层色谱供试品溶液所显主斑点的颜色和位置与对照药材溶液的斑点一致。故5种不同地区批号的供试品均含有桑叶原药材的化学成份。

通过对不同产地5批桑叶原药材、流浸膏和干膏的芦丁含量测定，结果表明各样品之间的芦丁含量具有明显的差异，即便是同一产地不同批号的样品芦丁含量也存在很大的差别。5批不同产地批号原药材、流浸膏和干膏芦丁含量的大小次序是一致的，广西090901的含量最高分别是0.30%、0.124%和0.048%，湖北2最低分别是0.11%、0.095%和0.035%。浸出物的含量测定亦有差异，但均符合标准。水分测定几乎无差异，符合规定。

[1] 江苏新医学院.中药大辞典(下册)[M].上海：上海人民出版社，1997:323-325.

[2] 孙莲,杨文菊,刘龙.桑叶挥发油气相色谱-质谱指纹图谱研究[J].中国中药杂志,2009,34(7)：879-883.

[3] 孙敏耀,唐文照,卢霞,等.分光光度法测定不同采收时间桑叶中总黄酮[J].中草药,2004,35(10)：1190-1191.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：化学工业出版社,2005：31-56.

Objective To study the quality of medicinal herbs of Mulberry Leaf. The quality of medicinal herbs is studied quantitatively by determining the content of extracts and component indices of Mulberry Leaf medicinal herbs and TLC of the herbs. Methods The chromatographic separation was achieved on a Diamonsil ODS-C18 column with amobile phase of methanol-acetonitrile-aceticacid-water solution(15:10:2.6:72.4). The fl ow rate was 1.0 mL.min-1and the column temperature was 30℃. Results The differences can be seen obviously among 5 batches of sample of rutin content in origin mulberry leaf raw herbs, fl ow paste and dry extract from different places. Additionally, though the samples of rutin content of different batches from the same origin, there is also a big difference. The content of Guangxi 090901 maximum is 0.30%, 0.124% and 0.048%, and Hubei 2 lowest is 0.11%, 0.095% and 0.035%, respectively. Conclusion According to determination and analyses of the content of extracts and component indices of Mulberry Leaf medicinal herbs, the quality of medicinal herbs would be controlled better from a quantitative point of view.

Mulberry Leaf; Extract; HPLC; Content determination

10.3969/j.issn.1009-4393.2012.25.098

300211 天津市河西区友谊医院 （李克雄） 510006 广东药学院药剂系（高崇凯）