盐酸右美托咪定预处理对缺血-再灌注损伤大鼠心肌Bax和Bcl-2表达的影响*

陈 盼,赵 明,蒋 鹏,王胜军,谷腾飞

(江苏省镇江市江苏大学附属医院麻醉科 212000)

盐酸右美托咪定预处理对缺血-再灌注损伤大鼠心肌Bax和Bcl-2表达的影响*

陈 盼,赵 明△,蒋 鹏,王胜军,谷腾飞

(江苏省镇江市江苏大学附属医院麻醉科 212000)

目的研究盐酸右美托咪定对大鼠心肌缺血-再灌注损伤时心肌凋亡相关基因Bax和Bcl-2表达的影响｡方法 将21只健康SD大鼠随机分为3组:假手术组(sham组,n=7)､缺血-再灌注组(I/R组,n=7)､缺血-再灌注+盐酸右美托咪定组(DEX组,n=7)｡采用结扎左冠状动脉前降支的方法制备在体大鼠心肌缺血-再灌注损伤模型｡采用RT-PCR､免疫组化方法检测Bcl-2和Bax mRNA､蛋白的表达,TUNEL法检测凋亡细胞TTC染色测定心肌梗死面积｡结果与sham组比较,I/R组Bcl-2和Bax mRNA和蛋白表达增加(P0.05);与I/R组比较,DEX组Bcl-2mRNA和蛋白表达升高(P0.05),Bax mRNA和蛋白表达下降(P0.05),凋亡细胞明显减少(P0.01),心肌梗死面积减小(P0.05)｡结论盐酸右美托咪定预处理可上调心肌缺血-再灌注损伤大鼠心肌Bcl-2mRNA和蛋白表达,下调Bax mRNA和蛋白表达,表明盐酸右美托咪定在心肌缺血-再灌注损伤中有抗凋亡的作用｡

心肌缺血;心肌再灌注损伤;细胞凋亡;基因,bcl-2;右美托咪定

心肌缺血-再灌注损伤(myocardium ischemia-reperfusion injury,MIRI)是心肺复苏､心肌梗死溶栓和介入治疗以及心脏移植中的重要病理生理过程[1]｡大量基础和临床研究表明缺血､缺氧后的再灌注不仅可以导致细胞的坏死,也可以诱导细胞的凋亡,所以在缺血-再灌注损伤中,细胞凋亡是其众多机制之一[2]｡盐酸右美托咪定是高选择性α2-受体激动剂,其在镇静､镇痛方面的研究已经有报道,但对其在缺血-再灌注损伤中的保护作用的报道却不多｡本研究通过建立大鼠在体心肌缺血-再灌注损伤模型,观察盐酸右美托咪定对大鼠心肌缺血-再灌注损伤后心肌组织中Bcl-2和Bax的表达,旨在探讨盐酸右美托咪定在心肌缺血-再灌注损伤中的抗凋亡作用及其可能的作用机制｡

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 盐酸右美托咪定注射液200μg/2mL(江苏恒瑞医药有限公司提供,批号:10110434)､Rotor-Gene 6000荧光定量PCR仪;Bcl-2､Bax和β-actin引物均由上海生工合成;逆转录试剂盒和RT-PCR试剂盒购于TAKARA公司;Trizol Reagent试剂盒购于Invitrogen公司;兔抗鼠Bcl-2多克隆抗体､兔抗鼠Bax单克隆抗体､TUNEL试剂盒均购于武汉博士德公司;2,3,5-氯化三苯基 四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)购自美国Sigma公司｡

1.2 实验动物分组与处理 健康3个月龄SD雄性大鼠21只,体质量250～300g,江苏大学动物中心提供｡随机分成3组:假手术组(sham组,n=7)､缺血-再灌注组(I/R组,n=7)､

1.5 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件处理分析数据,所有计量数据均以±s表示｡多样本均数组间比较用单向方差分析(one-way ANOVA),多样本均数间两两比较采用最小显著差数法分析,两组间差异检验采用t检验,P0.05示差异有统计学意义,P0.01提示差异有显著统计学意义｡

2 结 果

2.1 盐酸右美托咪啶对大鼠心肌梗死面积的影响 由TTC染色结果可见sham组染色后心肌呈深红色;I/R组和DEX组可见明显的灰白色梗死灶,且DEX组的梗死面积明显缩小,与I/R组比较,差异有统计学意义(P0.05)｡见表1｡

2.2 Bcl-2､Bax的 RT-PCR检测 I/R组和 DEX组,与sham缺血-再灌注+盐酸右美托咪定组(DEX组,n=7)｡除sham组左冠状动脉穿线不结扎,连续观察105min外,其余两组均结扎左冠状动脉前降支缺血30min,再灌注60min,DEX组在结扎前30min经腹腔注射盐酸右美托咪定注射液100μg/kg,sham组和I/R组在结扎前30min腹腔注入等量的生理盐水｡

1.3 大鼠心肌缺血-再灌注模型的建立 参照文献[3-4]制备心肌缺血-再灌注损伤模型｡

1.4 检测方法与指标

1.4.1 心肌梗死面积测定 建模成功后,迅速取出心脏,用生理盐水洗去血液,将左心室水平切成约2mm的薄片,置于37℃0.5%TTC磷酸缓冲液中染色15min,用以区分坏死区(灰白色)和非坏死区(深红色)并称质量,梗死面积以坏死区心肌质量占左室质量的百分比来表示｡

1.4.2 Bcl-2和Bax的mRNA的检测 将制备成功的模型动物断头处死,迅速取大鼠心肌缺血区域的组织,提取总RNA后,按照TAKARA试剂盒将总RNA逆转成cDNA并保存于-20℃冰箱｡应用SYBR Premix Ex Taq RT-PCR试剂盒,按照说明书以大鼠心肌组织的cDNA为模板在Rotor-Gene 6000荧光定量PCR仪上进行扩增及定量分析｡设定β-actin为内参基因(正向引物:5′-CCTGTACGCCAACACAGTGC,反向引物:5′-ATACTCCTGCTTGCTGATCC)｡Bcl-2引物(正向:5′-TCCAAGCAAAACGTC-CAGA,反向:5′-TCCTTCCCCAGTTAATGATGC):94℃30s→94℃30s→60℃20s→72℃20s(35个循环)｡Bax引物(正向:5′-AAAGTGCCCGAGCTGATC,反 向:5′-AGGACTCCAGCCACAAAGA):94 ℃ 30s→94℃30s→61℃20s→81℃20s(35个循环),扩增循环结束后,进行熔解曲线分析,用2-△ct△ct方法进行计算和统计｡

1.4.3 免疫组化法检测Bcl-2和Bax蛋白的表达 剪下缺血区心肌于10%甲醛固定24h,石蜡包埋切片,按试剂盒说明书用免疫组化法染色｡光学显微镜下观察,Bcl-2蛋白染色呈棕黄色颗粒,位于核膜或胞浆内;Bax蛋白染色呈棕黄色颗粒,位于细胞浆内｡在每张载玻片上随机选择10个区域,免疫阳性细胞率=免疫细胞阳性数/(免疫细胞阳性数+免疫细胞阴性数)×100%｡

1.4.4 TUNEL法检测凋亡细胞 剪下缺血区心肌于10%甲醛中固定24h,石蜡包埋切片,按TUNEL试剂盒说明书进行标记染色､凋亡的细胞核染成棕黄色,未凋亡的细胞核为蓝色｡高倍镜下每张切片随机选取10个视野,计数凋亡心肌细胞数和心肌细胞总数,以凋亡指数反映各组心肌凋亡的情况,凋亡指数=视野内凋亡细胞个数/视野内所有心肌细胞个数×100%｡组相比,Bcl-2mRNA表达增高(P0.05),Bax mRNA表达增高(P0.05);DEX组与I/R组比较,Bcl-2mRNA 表达增高(P0.05),Bax mRNA表达降低(P0.05),见图1､2｡

表1 大鼠心肌组织梗死范围(±s,n=7)

表1 大鼠心肌组织梗死范围(±s,n=7)

*:P0.05,与I/R组比较｡

组别 n 心肌梗死面积(%)7 0 I/R组 7 29.86±0.75 DEX组 7 23.60±0.55 shame组*

图1 大鼠心肌组织Bcl-2mRNA表达

图2 大鼠心肌组织Bax mRNA表达

2.3 Bcl-2和Bax蛋白表达的影响 I/R组和 DEX组,与sham组相比,Bcl-2蛋白表达增高(P0.05),Bax的蛋白表达增高(P0.05);DEX组与I/R组比较,Bcl-2的蛋白表达增高(P0.05),Bax的蛋白表达降低(P0.05),见表2｡

表2 心肌组织Bcl-2､Bax蛋白表达和凋亡细胞阳性率(±s,n=7)

表2 心肌组织Bcl-2､Bax蛋白表达和凋亡细胞阳性率(±s,n=7)

*:P 0.01,与sham组比较;△:P0.05,与I/R组比较｡

组别 Bcl-2(%) Bax(%) 凋亡指数Sham组10.1±0.40 11.57±0.53 3.14±0.40 I/R组 23.71±0.51* 49.28±1.19* 30.86±0.91*DEX组 33.29±0.75*△ 35.43±0.65*△ 19.71±0.75*△

2.4 I/R组大鼠缺血区心肌可见大量凋亡细胞 TUNEL法检测细胞凋亡的结果,sham组大鼠缺血区心肌极少见凋亡细胞;DEX组比I/R组凋亡细胞明显减少(P0.01),见封3图3｡

3 讨 论

细胞凋亡是细胞主动的､通过基因严密调控的程序性死亡｡Bcl-2即B细胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因,通过其所编码Bcl-2蛋白而发挥其抑制细胞凋亡的功能,它是一个多基因家族,Bcl-2和Bax蛋白是此家族的两个主要成员,Bcl-2有抗凋亡的作用,而Bax则促凋亡｡若Bcl-2表达增多,则形成Bcl-2/Bcl-2同源二聚体,也可形成Bcl-2/Bax异源二聚体,均起抑制细胞凋亡的作用｡若Bax表达增多,形成Bax/Bax同源二聚体,则促进细胞凋亡发生｡细胞凋亡是心肌缺血-再灌注损伤作用机制之一,其他包括炎症反应､能量代谢障碍､钙离子超载和活性氧的大量产生等[5-6]｡

盐酸右美托咪定为高选择性α2-肾上腺素受体激动剂,具有镇静､镇痛､抗交感和抑制血浆中的儿茶酚胺释放作用,还有止涎､抗寒颤和利尿的作用[7]｡α2-受体是去甲肾上腺素受体的一个亚型,广泛分布在中枢神经系统内外,α2-受体有α2-A､α2-B和α2-C 3个亚型,这些受体调节各个系统的功能,如心血管系统､交感神经系统和血液系统等,中枢神经系统脑内α2-AR最密集的区域在脑的蓝斑,而盐酸右美托咪定已被证实的作用位点是蓝斑[8]｡Engelhard等[9]研究证明,盐酸右美托咪定对大鼠大脑不全性缺血-再灌注有神经保护作用,可能是通过 Madm-2(murine double minute 2)抑制 P53的活性,下调Bax和上调Bcl-2表达,产生抗凋亡作用｡Dahmani等[10]研究表明,在大鼠大脑缺血-再灌注损伤中,盐酸右美托咪定通过激活α2-肾上腺素受体,减少腺苷酸环化酶激活,增加磷酸化的黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)含量,发挥神经保护作用｡本研究结果表明,与sham 组比较,I/R组 Bcl-2､Bax的mRNA和蛋白表达量均增加,而DEX组与I/R组比较,Bcl-2 mRNA和蛋白表达量增加,Bax mRNA和蛋白表达量降低,凋亡细胞减少,而心肌梗死面积缩小与Okada等[11]的研究一致,表明盐酸右美托咪定预处理可以减少心肌细胞凋亡,减少心肌梗死范围,保护心肌组织｡盐酸右美托咪定在缺血-再灌注损伤过程中可促进Bcl-2mRNA和蛋白的表达,抑制Bax mRNA及蛋白的表达,可能是通过α2-肾上腺素受体-腺苷酸环化酶通道,增加磷酸化的FAK含量,再介导FAK-Ras-MAPK通路和FAS-PI3K通路,上调Bcl-2表达的同时下调Bax的表达,发挥抗凋亡作用,保护缺血-再灌注的心肌细胞;有研究表明盐酸右美托咪定可降低大脑缺血的大鼠血浆中的儿茶酚胺的浓度[12],产生神经保护作用｡因此,盐酸右美托咪定也可能通过激动交感神经末梢的突触前α2-受体兴奋,降低循环中的去甲肾上腺素的释放并降低血浆中的儿茶酚胺的浓度,减少细胞内Ca2+内流｡

本研究初步认为,盐酸右美托咪定能抑制心肌缺血-再灌注损伤时心肌细胞凋亡的发生,保护心肌细胞,但更多保护机制有待在今后的研究中进一步证实｡

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Effects of dexmedetomidine on myocardial expression of Bax and Bcl-2 in rat myocardial ischemia/reperfusion injury*

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ObjectiveTo investigate the effect of dexmedetomidine on the expression of Bcl-2and apoptosis related protein Bax in rat myocardium apoptosis during ischemia reperfusion.Methods21healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3groups:sham group,I/R group(I/R group)and IR+dexmedetomidine group(DEX group).Ligation of left anterior descending coronary artery was performed for establishing the rat myocardial ischemia/reperfusion injury mode in vivo.Real-time and immunohistochemistry were used to analyze the expression of Bcl-2and Bax at mRNA and protein leves,TUNEL was used to analyze apoptoic index and TTC staining was adopted to investigate the infract size.ResultsCompared with the sham group,the expression of Bcl-2at mRNA and protein level were increased in the I/R group(P0.05),the expression of Bax at mRNA and protein level was significantly increased in the I/R group(P0.05).Compared with the I/R group,the expression of Bcl-2at mRNA and protein level was heightenend(P0.05)in the DEX group,Bax at mRNA and protein level was decreased in the DEX group(P0.01).The infract size and apoptotic index were reduced compared with the IR group.ConclusionDexmedetomidine can inhibit the apoptosis of myocardium by up-regulating the expression of Bcl-2and down-regulating the expression of Bax at mRNA and protein level,which may be part of the molecular mechanism of dexmedetomidine on myocardial preservation.

myocardial ischemia;myocardial reperfusion injury;apoptosis;gene,bcl-2;dexmedetomidine

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.16.016

A

1671-8348(2012)16-1604-03

* 基金项目:江苏省镇江市科技支撑-社会发展项目(SH2010014);江苏大学临床医学科技发展基金(jly2010136)｡△

,Tel:13952852326;E-mail:lightzhao168@163.com｡

2011-10-14

2011-12-09)

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