血红素氧合酶-1在姜黄素抑制氧化型低密度脂蛋白诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用

钟 毅,赖文岩,刘挺榕,郭志刚

(南方医科大学南方医院心内科,广州 510515)

血红素氧合酶-1在姜黄素抑制氧化型低密度脂蛋白诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用

钟 毅,赖文岩,刘挺榕,郭志刚△

(南方医科大学南方医院心内科,广州 510515)

目的观察姜黄素对氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响,并探讨血红素氧合酶-1(HO-1)在姜黄素抑制血管平滑肌细胞增殖中的作用及机制｡方法 体外分离培养大鼠血管平滑肌细胞并行免疫组化鉴定,以四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞增殖率､逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测HO-1mRNA水平,蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测HO-1及增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达水平｡结果Ox-LDL呈浓度依赖性(0～150μg/mL)地诱导VSMC增殖,达到200μg/mL具有细胞毒性;姜黄素呈浓度依赖性(40､80μmol/L)地抑制 Ox-LDL(100μg/mL)所诱导的VSMC增殖,HO-1抑制剂锌原卟啉Ⅸ(ZnPPⅨ)可明显减弱此抑制效应;姜黄素可诱导VSMC上调HO-1mRNA和蛋白表达;姜黄素可减弱Ox-LDL诱导VSMCs增殖细胞核抗原的高表达,此效应可被HO-1抑制剂ZnPPⅨ抑制｡结论姜黄素通过降低HO-1介导的PCNA表达,进而抑制Ox-LDL诱导大鼠血管平滑肌增殖｡

姜黄素;氧合酶类;脂蛋白类,LDL

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发生机制十分复杂,目前研究表明氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,Ox-LDL)及血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖是动脉粥样硬化斑块形成的重要病理基础[1]｡姜黄素是从姜黄､郁金､莪术等植物中提取的一种生物多酚化合物,研究显示姜黄素具有抗炎､抗氧化､促细胞凋亡和抑制细胞增殖等药理作用,这些作用可有效拮抗AS的发生与发展｡血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是血红素降解的起始酶和限速酶,发挥着抗炎､抗氧化､抑制细胞凋亡和改善组织微循环作用,动物研究已经证明过表达HO-1可以明显延缓AS进展[2],但是姜黄素抗AS的相关机制还不甚清楚｡本研究旨在于细胞水平探讨姜黄素对Ox-LDL诱导血管平滑肌细胞增殖的影响及其相关机制,为其药理作用提供理论基础｡

1 材料与方法

1.1 材料 DMEM培养基､胎牛血清､胰蛋白酶购自美国Gibico公司;姜黄素､锌原卟啉Ⅸ(zine protoporphyrinⅨ,Zn-PPⅨ)购自Sigma公司;Ox-LDL购于北京普博斯生物科技有限公司;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂均购自美国Invitrogen公司;一抗､二抗均购于美国Santa Cruz公司;SD大鼠购自南方医科大学实验动物中心;其余实验相关产品购自碧云天生物技术公司｡

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与实验分组按常规组织贴块方法[3]原代培养并传代,取用第3～8代细胞｡免疫组化法鉴定血管平滑肌细胞｡血管平滑肌细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基于37℃､5%CO2下培养｡实验分组:(1)正常对照组:不加任何处理;(2)不同终浓度 Ox-LDL刺激组(0､50､100､150､200､250μg/mL);(3)不同终浓度姜黄素组(0､20､40､80μmol/L);(4)不同终浓度姜黄素组(0､20､40､80μmol/L)+Ox-LDL(100μg/mL)组;(5)Ox-LDL(100μg/mL)+姜黄素组;(6)姜黄素+ZnPPⅨ+Ox-LDL(100μg/mL)组｡

1.2.2 反转录-聚合酶链反应检测 HO-1mRNA 按 Trizol试剂盒说明提取总RNA｡取细胞RNA 1μL根据试剂盒说明书逆转录合成cDNA,进行PCR扩增｡HO-1:上游5′GGGTGACAGAAGAGGCTAAGACC 3′,下 游 5′ AGATTCTCCCCTGCAGAG AGAAG 3′｡扩增条件:94℃ 变性30s,56℃退火30s,72℃ 延伸45s,循环30次｡电泳条带采用凝胶成像系统分析｡

1.2.3 四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法比色测定VSMC增殖率 VSMC接种96孔培养板中(每孔1×104个细胞)孵育24h,换无血清DMEM培养基24h后弃培养液,按实验分组加入药物｡20h后加入5mg/mL MTT 10μL,孵育4h,终止反应｡弃孔内培养液上清液加二甲基亚砜100μL,选择492nm自动酶标光度计测定各孔吸光度值｡细胞增殖率计算公式:细胞增殖率(cell viability)= 处理孔A492/对照孔 A492×100%｡

1.2.4 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测 HO-1及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白表达水平 收集细胞并加入细胞裂解液裂解细胞,离心收集上清液,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法测蛋白浓度｡蛋白(30μg)经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDSPAGE)分离后转移至聚偏(二)氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜｡5%牛血清清蛋白室温封闭4h,加入一抗4℃过夜､二抗室温孵育2h,最后显像｡

1.3 统计学处理 数据均采用±s表示,采用单因素方差分析,总体有差异两两比较采用最小显著差数法｡采用SPSS13.0软件进行分析,P0.05为差异有统计学意义｡

2 结 果

2.1 大鼠血管平滑肌细胞鉴定 培养的第3代细胞经免疫细胞化学检测,特异性的α-actin在免疫细胞化学染色后,胞浆着色,呈阳性反应,在镜下可见胞浆内大量棕色､与细胞长轴平行的纤维细丝,即平滑肌α肌动蛋白,见封3图1｡

2.2 Ox-LDL对诱导大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响 Ox-LDL呈浓度依赖性(0～150μg/mL)地诱导 VSMC增殖,但是当达到200μg/mL刺激组时,细胞数目减少,提示到达此浓度可能具备细胞毒性｡各个浓度刺激组与空白对照组相比,细胞增殖显著,差异具有统计学意义(P0.05),见图2｡

2.3 姜黄素对Ox-LDL刺激的VSMCs增殖的影响 不同终浓度的姜黄素(40､80μmol/L)可明显抑制 Ox-LDL(100μg/mL)诱导的细胞增殖效应,且呈浓度依赖性;姜黄素(40､80 μmol/L)+Ox-LDL组与 Ox-LDL单独作用组相比,细胞增殖率显著降低,差异具有统计学意义(P0.05),见图3｡

图2 Ox-LDL对诱导大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响

2.4 HO-1抑制剂ZnPPⅨ对姜黄素抑制Ox-LDL所诱导的VSMC增殖的影响 给予HO-1抑制剂ZnPPⅨ预处理细胞后,姜黄素抑制Ox-LDL所诱导的VSMCs增殖效应减弱;姜黄素+ZnPPⅨ+Ox-LDL组与姜黄素+Ox-LDL组相比,细胞增殖率增加明显(P0.05),见图4｡

2.5 姜黄素对VSMC的HO-1表达的影响 不同浓度姜黄素组干预VSMC的HO-1mRNA和蛋白表达水平明显高于空白对照组,实验重复3次,见封4图5｡

2.6 姜黄素对Ox-LDL刺激VSMC的PCNA表达的影响

相比较于空白对照组,Ox-LDL可明显增强PCNA的表达;而姜黄素+Ox-LDL组与Ox-LDL组单独作用比较,可明显抑制PCNA的表达;在加入HO-1抑制剂ZnPPⅨ后,姜黄素+Ox-LDL组的抑制PCNA表达效应可被减弱,实验重复3次,见封4图6｡

图3 姜黄素对 Ox-LDL(100μg/mL)所诱导的VSMC增殖的影响

图4 ZnPPⅨ对姜黄素抑制Ox-LDL所诱导的VSMCs增殖的影响

3 讨 论

平滑肌细胞增殖是AS斑块形成过程中的重要环节,大量研究表明动脉血管壁增厚至斑块形成是AS病变的主要病理特征｡Ox-LDL促进AS形成的作用已被大量的研究所证实｡目前认为AS形成初期步骤是LDL进入内皮损伤部位的血管壁,氧化､诱导多种趋化因子,并激活单核细胞分泌不同的生长因子和细胞因子,刺激平滑肌细胞迁移､增殖｡因此,Ox-LDL在AS中起到关键作用｡

HO-1是血红素降解的起始酶和限速酶,HO-1通过降解血红素产生一氧化碳(carbon monoxide,CO)､胆绿素和铁离子｡胆绿素进一步经胆绿素还原酶作用生成胆红素,而铁离子能诱导铁蛋白的合成[4]｡HO-1的这些终产物具有抗炎､抗氧化､抗凋亡和抗血栓的作用;另外,CO和胆色素通过影响血管平滑肌细胞､内皮细胞､内皮祖细胞和粒细胞的增殖､迁移和黏附保护受损动脉血管内平衡[5]｡姜黄素是中药姜黄的主要成分,其抗炎､抗氧化､抗肿瘤､抗血栓以及心血管的保护作用已经被证实[6]｡目前已经有研究表明姜黄素具有抗细胞增殖的作用,但是具体机制还不甚清楚[7-8]｡根据其众多药理作用与HO-1保护作用相似,姜黄素的相关保护作用是否经过HO-1介导值得研究｡

本研究结果显示,Ox-LDL在一定浓度范围内浓度依赖性地诱导血管平滑肌细胞增殖,当超过一定浓度,具备细胞毒性｡此实验发现与Chang等[9]的研究结果相类似,说明了Ox-LDL对血管平滑肌细胞增殖影响的特点,其机制可能是通过激活Ras/Raf/MEK/MAPK通路促进细胞有丝分裂[10]｡与之类似,Schwer等[11]也发现姜黄素 HO-1介导抑制胰腺星状细胞的增殖由阻遏ERK1/2磷酸化的机制实现｡同时,本组也发现姜黄素可有效抑制Ox-LDL诱导血管平滑肌细胞增殖,并且此抑制效应可被HO-1的抑制剂ZnPPⅨ部分阻断｡这提示HO-1很可能参与了姜黄素抑制Ox-LDL诱导血管平滑肌细胞增殖的保护效应｡同样,有学者发现在球囊损伤的大鼠模型中,HO-1介导NO抑制大鼠血管平滑肌增殖,从而显著地抑制了内膜增生[12]｡为了进一步证实此发现,本组观察了姜黄素对血管平滑肌细胞HO-1mRNA和蛋白表达的影响,发现姜黄素可显著地上调血管平滑肌细胞HO-1mRNA和蛋白表达｡综上所得出的实验结果,提示姜黄素抗Ox-LDL诱导血管平滑肌细胞增殖的作用经过HO-1介导｡

PCNA又称周期蛋白,是一种与细胞增殖周期有关的核内糖蛋白,是DNA复制的必需成分,其表达与细胞增殖活性有关,是使细胞由静息期进入S期的关键蛋白[13],已成为评价细胞增殖状态的一项客观指标｡本组研究发现HO-1抑制剂上调姜黄素抑制Ox-LDL诱导VSMCs增殖细胞核抗原高表达,提示HO-1介导的抑制增殖的效应可能部分通过抑制PCNA表达实现｡另外研究发现HO-1的抗增殖效应通过上调细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子P21[14],P21是细胞周期素蛋白cdk-2抑制蛋白,cdk-2亦是细胞周期G1和S期调节关键｡Liu等[15]以含HO-1基因的重组腺病毒转染大鼠主动脉平滑肌细胞,被转染的大鼠主动脉平滑肌细胞以剂量依赖方式表达HO-1mRNA､HO-1蛋白和提高酶的活性,刺激促凋亡基因p53表达,促进VSMCs凋亡而抑制血清刺激的VSMCs增殖｡

综上所述,姜黄素显著地抑制Ox-LDL诱导的大鼠VSMC增殖,其机制是由HO-1介导的PCNA表达下调实现的｡这为进一步研究姜黄素防治AS提供了一定的理论依据｡

[1] Lusis AJ.Atherosclerosis[J].Nature,2000,407(6801):233-241.

[2] Li Q,Guo Y,Ou Q,et al.Gene transfer of inducible nitric oxide synthase affords cardioprotection by upregulating heme oxygenase-1via a nuclear factor-{kappa}B-dependent pathway[J].Circulation,2009,120(13):1222-1230.

[3] Owens GK,Loeb A,Gordon D,et al.Expression of smooth muscle-specific alpha-isoactin in cultured vascular smooth muscle cells:relationship between growth and cytodifferentia-tion[J].J Cell Biol,1986,102(2):343-352.

[4] Durante W.Protective role of heme oxygenase-1against inflammation in atherosclerosis[J].Front Biosci,2011,17:2372-2388.

[5] Durante W.Targeting heme oxygenase-1in vascular disease[J].Curr Drug Targets,2010,11(12):1504-1516.

[6] Goel A,Kunnumakkara AB,Aggarwal BB.Curcumin as“Curecumin”:from kitchen to clinic[J].Biochem Pharmacol,2008,75(4):787-809.

[7] Huang HC,Jan TR,Yeh SF.Inhibitory effect of curcumin,an anti-inflammatory agent,on vascular smooth muscle cell proliferation[J].Eur J Pharmacol,1992,221(2/3):381-384.

[8] Qin L,Yang YB,Tuo QH,et al.Effects and underlying mechanisms of curcumin on the proliferation of vascular smooth muscle cells induced by Chol:MbetaCD[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,379(2):277-282.

[9] Chang WC,Yu YM,Chiang SY,et al.Ellagic acid suppresses oxidised low-density lipoprotein-induced aortic smooth muscle cell proliferation:studies on the activation of extracellular signal-regulated kinase 1/2and proliferating cell nuclear antigen expression[J].Br J Nutr,2008,99(4):709-714.

[10]Yang CM,Chien CS,Hsiao LD,et al.Mitogenic effect of oxidized low-density lipoprotein on vascular smooth muscle cells mediated by activation of Ras/Raf/MEK/MAPK pathway[J].Br J Pharmacol,2001,132(7):1531-1541.

[11]Schwer CI,Guerrero AM,Humar M,et al.Heme oxygenase-1inhibits the proliferation of pancreatic stellate cells by repression of the extracellular signal-regulated kinase1/2pathway[J].J Pharmacol Exp Ther,2008,327(3):863-871.

[12]Cerrito MG,Scagliarini A,Froio A,et al.Heme oxygenase-1inhibition prevents intimal hyperplasia enhancing nitric oxide-dependent apoptosis of vascular smooth muscle cells[J].Biol Pharm Bull,2011,34(8):1204-1214.

[13]Morris GF,Mathews MB.Regulation of proliferating cell nuclear antigen during the cell cycle[J].J Biol Chem,1989,264(23):13856-13864.

[14]Notoya M,Nishimura H,Woo JT,et al.Curcumin inhibits the proliferation and mineralization of cultured osteoblasts[J].Eur J Pharmacol,2006,534(1-3):55-62.

[15]Liu XM,Chapman GB,Wang H,et al.Adenovirus-mediated heme oxygenase-1gene expression stimulates apoptosis in vascular smooth muscle cells[J].Circulation,2002,105(1):79-84.

Role of heme oxygenase-1 on curcumin inhibiting rat vascular smooth muscle cells proliferation induced by oxidized low density lipoprotein

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(,,,,510515,)

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of curcumin on oxidized(Ox)-low density lipoprotein(LDL)-induced rat vascular smooth muscle cells proliferation and to explore the role of heme oxygenase-1in this process.MethodsThe cultured aortic smooth muscle cells isolated from male Sprague-Dawley rats were verified by immunohistochemistry.The cell viability was assayed by MTT,and reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)was performed to determine the level of HO-1mRNA.In addition,HO-1and PCNA expression were analyzed by Western blotting.ResultsThe Ox-LDL remarkably stimulated VSMCs proliferation in a concentration-dependent manner(0-150μg/ml),however,the doses that exceeded 200mg/ml had a cytotoxic effect.Curcumin also attenuated the VSMCs proliferation effect of Ox-LDL in a concentration-dependent manner(40,80μM),the inhibitory effect was blocked by a HO-1inhibitor(zine protoporphyrinⅨ,ZnPPⅨ).Curcumin significantly upregulated HO-1mRNA and protein expression in a concentration-dependent manner.Furthermore,ZnPPⅨblocked the inhibitory effect of curcumin on Ox-LDL-induced PCNA expression.ConclusionCurcumin inhibits Ox-LDL-induced rat vascular smooth muscle cells proliferation via HO-1-mediated down-regulation of PCNA expression.

curcumin;oxygenases;lipoproteins,LDL

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.16.018

A

1671-8348(2012)16-1609-03

△ 通讯作者,Tel:(020)61641508;E-mail:guozhigang126@126.com｡

2011-09-11

2011-12-22)

•基础研究•