用微透析法测定氢溴酸东莨菪碱凝胶经皮给药大鼠体内药动学研究

陈 芳，胡晋红，朱全刚（第二军医大学长海医院药学部，上海200433）

咳喘膏是目前临床常用于治疗单纯型慢性气管炎、喘息型慢性气管炎、哮喘（除心脏引起的）等症的外用中药复方制剂，由芥子、甘遂、延胡索、细辛、洋金花等中药与适当基质制成。洋金花是其中一味非常重要的中药，其主要有效成分东莨菪碱具有广泛的药理活性，如解痉、麻醉、止痛等。为进一步研究咳喘膏经皮给药的体内过程，本研究将氢溴酸东莨菪碱制成凝胶制剂，用微透析取样技术研究其在大鼠皮肤内的药动学过程。

经皮微透析技术可以对实验动物或人体皮肤组织进行在体、连续的药物浓度测定，现已被广泛用于外用制剂的在体经皮吸收动力学研究。但所收集的微透析样品中药物浓度非常低，一般在纳克每毫升甚至皮克每毫升范围，并且由于微透析流速低，所收集的样品量一般只有几微升至几十微升。样品量少、浓度低的特点对建立分析方法提出了挑战［1］。HPLC－MS／MS法具有灵敏度高、特异性强、样品需求量少的特点。本研究建立了HPLC－MS／MS法测定微透析样品中东莨菪碱的浓度，并研究了氢溴酸东莨菪碱凝胶的大鼠经皮给药药动学过程。

1 材 料

1.1 药物和试剂 氢溴酸东莨菪碱原料药（广州环叶制药有限公司，批号070301）；氢溴酸东莨菪碱对照品（德国MSDS公司，纯度≥98%）；甲醇（色谱纯，美国Tedia公司）；甲酸铵、甲酸和三乙醇胺（上海凌峰化学试剂有限公司）；乙二胺四乙酸二钠（EDTA－2Na），磷酸氢二钠（汕头金沙化工一厂）；磷酸二氢钠（新华化工厂）；NaCl（泰昌美达试剂有限公司）；卡波姆（美国Lubrizol公司）；羟苯乙酯（湖北合天化工有限公司）；丙二醇（宜兴市毅达化工厂）；月桂氮酮（湖北南星化工总厂）。氢溴酸东莨菪碱凝胶由第二军医大学长海医院药学部实验室自制。

1.2 仪器 G－6410AHPLC－MS／MS联用仪（配有三重四级杆LC－MS系统、G1311四元泵、G1322真空泵、G1329A自动进样器和G1316A柱温箱），Zorbax Extend C18保护柱，Zorbax Extend C18色谱柱（美国安捷伦公司）。微透析系统：MD1001灌注器推进泵、MD0100灌注器、MD1002灌注器支架和MD1020流速控制器（美国BAS公司）。Franz扩散池（中国医学科学院有机所玻璃车间加工制备）。

1.3 实验动物 雄性SD大鼠，体重约200g，由第二军医大学实验动物中心提供，实验动物许可证号SCXK（沪）2007－0003。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 Zorbax Extend C18色谱柱（100mm×2.1mm，3.5μm），Zorbax Extend C18保护柱（12.5mm×2.1mm，5μm），流动相：甲醇－2mmol／L甲酸铵（25∶75，用甲酸调节pH 3.5），流速：0.3ml／min；进样量：1μl；柱温40℃。

2.2 质谱条件 离子源为电喷雾电离源（ESI），正离子扫描方式及多离子反应方式检测；离子源温度350℃；鞘气（N2）流速8L／min；雾化气压30Pa；毛细管电压4 000V；检测时间3min。在一级全扫描质谱图中获得氢溴酸东莨菪碱准分子离子峰为m／z 304.1，选择性对其进行二级质谱分析，得到主要碎片离子为m／z138.0（见图1），仪器自动优化相对碰撞能量为23。将上述离子对用于定量分析。

2.3 磷酸盐缓冲液溶液（PBS）的配制 分别称取磷酸二氢钠0.775g，磷酸氢二钠3.171g，氯化钠5.58g溶解于蒸馏水中，定容至1 000ml，用0.45μm的水系微孔滤膜过滤即得pH 7.4的PBS。2.4 储备液、对照品溶液、质控溶液的配制 精密称取适量氢溴酸东莨菪碱对照品置于100ml容量瓶中，用PBS溶解并稀释至刻度，配制成10μg／ml的东莨菪碱储备液。依次精密量取该储备液适量，置于10ml容量瓶中，用PBS稀释至刻度，摇匀，配制成5、10、20、50、100、200、500、1 000ng／ml的对照品溶液。同法配制20、100、500ng／ml的东莨菪碱质控溶液。

图1 东莨菪碱的HPLC－MS／MS谱图Figure 1 HPLC－MS／MS photogram of scopolamine

2.5 微透析样品处理 取5μl微透析溶液加入45μl PBS，混匀，涡旋3min，取5μl进行HPLC－MS／MS分析。

2.6 氢溴酸东莨菪碱凝胶处方及制作方法 处方：氢溴酸东莨菪碱0.5g，卡波姆1g，EDTA－2Na 0.03g，羟苯乙酯0.1g，丙二醇10ml，月桂氮酮5ml，三乙醇胺0.5ml，蒸馏水适量。制作方法：精密称取处方量氢溴酸东莨菪碱，用适量蒸馏水溶解，加入处方量卡波姆，溶胀过夜，此为1液。处方量EDTA－2Na用适量蒸馏水溶解，此为2液。将2液缓缓加入1液得3液。羟苯乙酯的丙二醇溶液缓慢加入3液，边加边搅拌。再先后加入月桂氮酮、三乙醇胺，用蒸馏水补足至100g，即得凝胶。

2.7 实验动物处理 SD大鼠3只，体重约200g，实验前一晚禁食。实验前用25%乌拉坦溶液3ml／kg腹腔注射麻醉动物，固定动物后在腹部剃除毛发，置皮肤微透析探针，将探针连接于微透析装置。

2.8 大鼠体内东莨菪碱回收率测定 用含不同浓度东莨菪碱的PBS（约20、100、200ng／ml，HPLC－MS／MS法测定灌流液中具体浓度cperf）灌注探针，流速2μl／min，平衡1h后，每20min收集一次透析液，收集4个样品后，更换高浓度的灌流液，依前面的方法平衡采样，直至采集好3个浓度的样品。HPLC－MS／MS进样5μl，测定透析液中的药物浓度（cdial），根据公式Rdial＝（cperf－cdial）／cperf计算浓度对东莨菪碱体内回收率的影响。结果3种不同浓度东莨菪碱在大鼠体内回收率分别为（35.21± 1.88）%、（33.14±4.60）%和（31.15±1.09）%（n＝3）。用含药浓度为200ng／ml的PBS在不同流速下（1.0、1.5、2.0、3.0μl／min）灌注探针。每种流速收集前平衡1h，各收集5份微透析样品，计算流速对东莨菪碱体内回收率的影响。不同流速下东莨菪碱在大鼠体内回收率分别为（90.34±2.53）%、（51.80±2.08）%、（29.62±2.79）%和（17.22± 2.70）%（n＝5）。

2.9 氢溴酸东莨菪碱凝胶体外经皮渗透实验 将透皮扩散池预热至34℃，将大鼠皮肤置于装有磁力搅拌子的Franz扩散池上，真皮层朝上。凝胶0.5g／池，均匀涂于皮肤表面，固定扩散池。在接收池中加入预热至34℃的PBS，开磁力搅拌，开始计时，分别于1、2、4、6、8、12h从接收池中取出全部接收液，并及时补充等量34℃的PBS。接收液于5.71×10－3×g离心10min，然后进行检测。结果凝胶中药物透过皮肤的渗透曲线见图2。以单位面积累计经皮渗透量对时间进行线性回归，得出凝胶剂中药物经皮渗透速率为112.14μg·cm－2·h－1，时滞为3.5h。

图2 氢溴酸东莨菪碱凝胶大鼠体外经皮渗透曲线Figure 2 The in vitro permeation curve of scopolamine hydrobromide gel in rats

2.10 氢溴酸东莨菪碱凝胶的经皮吸收药动学过程 用不含药物的PBS灌注探针90min后，在透析窗正上方局部皮肤用0.5%氢溴酸东莨菪碱凝胶（1.25mg／cm2）包封，平衡30min后，每隔20min收集1次透析液，收集12h。该凝胶经皮给药后20min～12h内均可检测到东莨菪碱的存在，且给药后药物在皮肤内浓度迅速升高，约150min时达到峰浓度，为（951.6±56.1）ng／ml，随后下降但其浓度能稳定在较高的水平（445～992ng／ml）。氢溴酸东莨菪碱在皮肤内的t1／2为（174.2±77.3）min，AUC0～t为（355 764.4±38 138.9）ng·min·L－1，经皮吸收动力学曲线见图3。

2.11 方法学考察

2.1 1.1 方法专属性 取大鼠空白皮肤下微透析样品进行HPLC－MS／MS分析，大鼠腹部皮肤给予东莨菪碱凝胶2h后取皮肤下微透析样品。结果表明，空白皮肤下未见待测物本底以及其他干扰物质影响氢溴酸东莨菪碱的测定。

2.1 1.2 标准曲线的绘制 参考文献［2，3］，以PBS作为空白基质，采用标准加入法制作标准曲线的样品，得离子流图。以待测物质量浓度为横坐标（X），以待测物的峰面积为纵坐标（Y），用加权（权重系数1／X2）最小二乘法进行回归计算，得到标准曲线的回归方程为Y＝0.6 X＋0.001 6（r＝0.999 8）。东莨菪碱在5.0～1 000ng／ml的浓度范围内线性关系良好。

图3 氢溴酸东莨菪碱凝胶经皮吸收动力学曲线Figure 3 The percutaneous absorption kinetics curve of scopolamine hydrobromide gel n＝3

2.1 1.3 精密度实验 取20、100、500ng／ml的质控溶液，每个浓度进行5个样本分析，连续测定3d，以当日的标准曲线计算样品的浓度，考察日内和日间精密度，结果其日内RSD分别为1.81%、0.60%、0.57%（n＝5）；日间RSD分别为3.00%、0.33%、0.32%（n＝5），表明精密度良好。

3 讨 论

微透析样品体积小，所含被测物的浓度一般都比较低，因此对分析方法的灵敏度要求很高，HPLC－MS／MS法因其具有高效、快速、灵敏度高、特异性强的特点，因而在微透析样品的分析中越来越受到重视。将探针埋置人皮下所造成的创伤是很轻微的，但是也有可能产生红斑、组织中小分子物质浓度和组织血液灌流量改变，影响研究结果。因此国外文献报道在埋置探针后到局部给药前应有一段平衡时间，通常为60～90min［4，5］。

在微透析取样方法中，探针回收率的准确校正是获得组织液内真实药物浓度的关键。最常用的用于校准探针回收率的方法有慢流速法、零净流量法、内标法和反向透析法。反向透析法由于更快速和更方便的优势而被广泛用于体内回收率的测定。本研究就是采用反向透析法测定探针的回收率，且从结果可以看出探针的回收率与药物浓度无关。

从氢溴酸东莨菪碱凝胶体内药动学过程可以看出，该药物能迅速透过皮肤被吸收，约在150min时即达到最高浓度，后缓慢下降但浓度能维持在一较高的范围内，随后该药物在皮下的浓度迅速下降，提示临床使用该药物时需注意给药间隔。本研究成功建立了HPLC－MS／MS法检测大鼠皮下微透析样品中东莨菪碱的含量，并考察了氢溴酸东莨菪碱凝胶经皮给药后在皮下的药动学过程。在实验过程中发现，氢溴酸东莨菪碱凝胶的皮下浓度在各个探针和大鼠之间有差异，推测造成该差异的原因可能是各大鼠对药物的皮肤屏障作用以及皮肤代谢和皮肤清除作用不一致，而非微透析技术自身缺陷所造成［2］。

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