着丝粒特异组蛋白CENH3的研究及应用

周淑芬

（福建省农业科学院生物技术研究所，福建 福州 350003）

着丝粒由DNA和蛋白质组成，是真核生物有丝分裂和减数分裂过程中染色体正确分离和传递所必需的染色体区域。虽然着丝粒的功能非常保守，但真核生物各物种的着丝粒DNA序列却是高度变异的。相比之下，着丝粒蛋白在物种间则相对比较保守。根据它们在细胞周期中与着丝粒的关系，可将着丝粒蛋白分为两种，即只在有丝分裂过程中短暂出现的兼性蛋白和在整个细胞周期都存在的基本蛋白。着丝粒特异组蛋 H3（centromere－specific histone H3，CENH3）是较早被发现的一种基本蛋白，是功能着丝粒染色质最基本的特征，在着丝粒染色质的识别和保持中起着关键作用，对其进行研究具有重要意义。本文主要围绕CENH3的发现及进化、结构与功能及应用等展开综述。

1 CENH3的发现及进化

CENH3是一个着丝粒特异的组蛋白H3突变体，只存在于真核生物的功能着丝粒中［1－2］。自从在人类的活性着丝粒中鉴定了第一个CENH3——CENP－A以来［3］，相继在芽殖酵母、秀丽杆线虫、鼠、果蝇、裂殖酵母等生物获得了CENP－A的同源物［4］。最近，又鉴别了玉米、拟南芥、水稻、甘蔗等植物的CENH3［5－8］。在玉米和拟南芥中，进一步通过CENH3抗体进行免疫染色，结果表明CENH3存在于整个细胞周期的着丝粒中。

与组蛋白H3相比，CENH3在进化上则是快速的，在不同物种甚至是同一物种的不同亚种之间的CENH3都会出现一定程度的适应性进化。NAGAKI等［1］对拟南芥、烟草、水稻和地杨梅等四种植物的CENH3进行聚类分析，发现它们的N端区域具有多样性。对水稻不品种的CENH3基因及转录本进行，发现它们具有血统特异的适应性进化［9］。CENH3的这种适应性进化现象可能与快速进化的着丝粒卫星DNA有关。

2 CENH3的结构与功能

CENH3包含氨基端（氨基末端尾巴）和羧基端（组蛋白质折叠域，HFD）两个结构域。氨基末端尾巴是生存所必需的，其长度和序列高度可变，可能与其他着丝粒蛋白相互作用有关［10］。相比之下，组蛋白质折叠域（HFD）则比较保守，包括了4个α螺旋（αN、α1、α2、α3）和2个环（Loop1和Loop2）。同源比对分析发现，人类CENP－A与哺乳类动物CENH3的组蛋白折叠域具有60%同源性。相对于组蛋白折叠域的其他结构，α1、α2螺旋及Loop1环显得更具有多样性，可能与CENH3的DNA结合专一性密切相关。在人类中发现CENP－A－H4比H3－H4四聚体结构更紧凑、更刚硬［11］，导致这种差异的区域包括组蛋白折叠域的Loop1环。在果蝇和拟南芥中还发现，CENH3的Loop1环及核心序列的一个邻近区发生了适应性进化［6，12］，而且果蝇的Loop1环是其CID（CENH3）在着丝粒定位的必要和充分条件。

CENH3存在于真核生物活性着丝粒的核小体中，取代了核小体组蛋白八聚体中的组蛋白H3［13］，是着丝粒形成的早期标志。CENH3可募集其他着丝粒蛋白并与它们形成复合体，决定着丝粒的组装及染色体的正常分离与传递。在果蝇和老鼠中的实验发现，当破坏CENH3时，所有被检测的着丝点蛋白都被错误定位［14］。GOSHIMA等［15］应用RNAi方法敲减人类CENP－A基因，发现染色体分离发生错分。说明CENH3对着丝粒的组装和功能的正常发挥至关重要。

3 CENH3的应用

CENH3是功能着丝粒的共同基础，可作为功能着丝粒染色质的识别标记，目前利用该蛋白进行生物学研究主要包括以下几个方面。

3.1 功能着丝粒的边界和大小的确定

由于CENH3是功能着丝粒的一个基本组分，因此可通过CENH3抗体的染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，CHIP）实验，鉴别与CENH3相互作用的DNA序列，进而确定功能着丝粒的边界和大小。实验研究表明，与CENH3相连的着丝粒染色质只包含一小部分卫星DNA［7，16］。在栽培稻第8号染色体的着丝粒（CEN8）中，与CENH3结合的卫星DNA（CentO）约750kb，即其功能着丝粒的大小约为750 kb。玉米A染色体着丝粒中与CENH3结合区域为含有300～700kb的混合CentC和CRM重复序列，玉米B染色体的CENH3结合区为700kb，因此玉米染色体中的功能着丝粒大小约300～700 kb。

3.2 功能着丝粒DNA序列的鉴定

通过用CENH3抗体进行染色质免疫沉淀（CHIP）实验，可以确定所检测的DNA序列是否属于着丝粒的功能DNA元件；同时对与CENH3抗体发生免疫沉淀的染色质进行克隆与分析，可获得功能着丝粒DNA序列。拟南芥、玉米、水稻和甘蔗等植物中通过CHIP实验表明，它们的卫星DNA和反转录转座子元件（CRR）能被CENH3的抗体沉淀，即与CENH3发生相互作用，说明了卫星DNA和反转录转座子元件CRR是这些物种着丝粒的功能组分［17］。

3.3 利用改造的CENH3介导染色体消除获得单倍个体

此方法目前在拟南芥中得到证实，RAVI等［18］通过对编码拟南芥着丝粒特异组蛋白CENH3的基因进行改造，利用转基因技术将其导入cenh3拟南芥突变体中获得只表达人工改造CENH3基因的转基因植株，以此为母本与野生型父本的杂交后代中会出现最高诱导率达45%的单倍体植株，有趣的是获得的单倍体植株基因组中只含有来自父本的野生型基因组，而来自母本的含有人工改造CENH3的染色体组被从合子中剔除。采用同样的方法，与四倍体拟南芥杂交，也成功获得了倍性减半的二倍体植株。该方法将基因工程技术与常规的杂交育种手段相结合，达到改变染色体倍性的目的，为研究单倍体的形成机制提供很好的依据，同时该方法也是一种利用转基因技术生产非转基因植物的良好策略。由于CENH3普遍存在于真核生物中，因此这种方法可以推广到其他物种单倍体诱导中。

4 问题与展望

目前对CENH3的结构和功能已有了一定的了解，但它如何影响着丝粒的形成、着丝粒功能的正确行使、与其他着丝粒蛋白的相互作用尚不清楚，非整倍体的成因仍有待于进一步探究。核心组蛋白的翻译后修饰决定着基因组中染色质的不同状态，在人类和果蝇的着丝粒组蛋白CENH3中发现具有独特的修饰组合，但在栽培稻的着丝粒组蛋白CENH3不具有独特的修饰组合，进一步解析着丝粒染色质的组蛋白修饰，对于认识着丝粒染色质的特征及其与着丝粒功能的关系将会有很大帮助。近几年来，RNA干扰技术的应用及人工染色体的成功构建，对着丝粒蛋白的研究更为便利和精确。

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